专利名称：一种快速鉴定烟草野火病菌的试剂盒及其鉴定方法
技术领域：
本发明涉及植物病原细菌的免疫测定法技术领域，具体涉及对烟草野火病菌进行 鉴定的试剂盒及其鉴定方法。
背景技术：
烟草野火病(其病原学名为Pseudomonas syringae pv. tabaci)是由烟草假单胞 杆菌引起的细菌性病害。20世纪90年代以来，由于生产上大面积种植感病品种和品种单 一等原因，该病害成为烟草生产上的一大难题。我国所有种烟省区皆有发生，尤以黑龙江、 吉林、辽宁、山东、四川、云南等烟区发病较为严重，许多烟田发病率高达40%以上，有的甚 至达100%，造成绝产绝收。烟草感病后严重影响烤烟品质及产量，为预防烟草野火病的危 害，对烟草野火病菌其进行快速、准确的鉴定是防效的关键之一。
现代血清学技术的迅速发展，为细菌性病害的种类鉴定、种群动态分布、发生流行 规律研究及监测提供了快速、灵敏、准确的方法。血清学技术是以抗原、抗体为基础，利用抗原-抗体的特异性反应来检测、鉴定病 原的。常用的血清学方法包括凝集反应测定法(包括有玻片凝集反应和试管凝集反应)、 酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA，简称 ELISA 法)等。 ELISA法是目前植物细菌性病害诊断上应用较广泛的一种免疫学方法(张爱红等，2008，几 种植物病原细菌的检测技术和鉴定技术，河北农业科学，12(8) 30-32)。对于植物病原菌检测，最近使用最多的是金黄色葡萄球菌A蛋白酶联免疫吸附测 定法(简称SPA-ELISA法)，该方法在保持了 ELISA法中的双抗夹心法灵敏度的同时，免除 了制备两种抗体的麻烦，同时由于金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein Α、简 称SPA)本身的特性，大大缩短了与抗体孵育的时间。但是，上述血清学方法在检测和鉴定植物病原细菌方面各有优点，但也存在一些 缺陷，如凝集反应的优点在于简便、快速，但灵敏度和专化性中等，而SPA-ELISA灵敏度和 专化性都很好。长期以来对于烟草野火病的鉴定和检测主要是根据症状学特征，病原菌形态特征 和生理生化特性，存在耗时较长、灵敏性、准确性较差的不足。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鉴定烟草野火病菌的试剂盒及其用该试剂 盒鉴定烟草野火病菌的方法，该试剂盒及其用该试剂盒鉴定烟草野火病菌方法能简便、快 速、灵敏、准确地鉴定烟草野火病。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一是提供一种快速鉴定烟草野火病菌 的试剂盒，该试剂盒由酶标反应板和相关试剂构成，所述的相关试剂有以下部分(1)抗血清PsY5A，所述的PsY5A抗血清是通过检测菌株的致病性筛选致病力强的 烟草野火病Pseudomonas syringae pv. tabaci Y5菌株为抗原，通过免疫注射健康新西兰大耳兔，按照颈动脉放血方法获得。(2)0. 05M ρΗ9· 6 包被缓冲液(coating buffer, CB，简易配方=Na2CO3L 59g， NaHC032. 93g，加蒸馏水至1000ml即可)(3) 0. OlM ρΗ7· 4 磷酸缓冲液(PBS)(4)1父卩8511洗涤液吐 温-20(即1￥6611-20) :0.5ml 加 0. OlM pH7. 4PBS 至 IOOOml(5)ρΗ5. 4的底物缓冲液，其中A 液为 0. IM 柠檬酸 2. 22ml ；B 液为 0. IM Na2HPO4 2. 78ml 加蒸馏水 IOml ；(6)四甲基联苯胺底物反应液(即TMB底物反应液)所述的四甲基联苯胺底物反 应液由四甲基亚砜配制成10mg/ml四甲基联苯胺100 μ 1，加入0. 65% Η20225 μ 1，再加入上 述底物缓冲液至IOyl ；(7)金黄色葡萄球菌A蛋白纯品(SPA)及辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A 蛋白(HRP-SPA)，所述的金黄色葡萄球菌A蛋白纯品的工作浓度为2. 5μ g/ml，以包被缓冲 液先配成lmg/ml母液，4°C贮备；所述的辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白的工作 浓度为1 40 ；(8)阳性对照物为烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci)丫5株系的菌 悬液，菌体浓度为5X108cellS/ml。上述金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)为华美生物工程公司产品，上述辣根过氧化物 酶标记A蛋白(HRP-SPA)为上海科欣生物技术研究所产品。为解决上述技术问题，本发明的另一技术方案是提供一种用上述一种快速鉴定烟 草野火病菌的试剂盒对烟草野火病菌进行鉴定方法，该方法按以下步骤进行(1)供试样品的处理将样品混勻，称取种子或烟株组织5g放入研钵中，加入 0. OlM磷酸盐缓冲液(PBS) 20ml研磨，静置3h 4h，备用。(2)用所述的快速鉴定烟草野火病菌的试剂盒鉴定(1)中所述的样品处理液，并 依如下步骤进行①包被金黄色葡萄球菌A蛋白，其工作浓度为2. 5 μ g/ml，200 μ 1/孔，4°C过夜；②加入用0.01M磷酸缓冲液稀释5000倍的一抗，200μ 1/孔，37°C孵育3h或4°C 过夜，0. OlM PBST洗板5次，5min/次；③加入供试样品处理液，200ul/孔，37°C孵育3h ；④用0. OlM PBST 洗板 5 次，5min/ 次；⑤加入用0.01M磷酸缓冲液稀释2000倍的二抗，200μ 1/孔，37°C孵育2h或4°C 过夜，洗涤同④；⑥加入辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白，其工作浓度为1 40，200ul/ 孔，37°C孵育2h或4°C过夜，洗涤同④；⑦加入四甲基联苯胺底物反应液，100 μ 1/孔，37°C孵育10 20min ；⑧加入2M H2SO4终止反应，50 μ 1/孔，在酶联免疫检测仪上读0D450值，P/N> 2.0 判为阳性。(3)阳性对照为烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci) Y5株系的菌悬 液，菌体浓度为5X108cellS/ml ；
(4)空白对照为无菌水。与现有技术相比，本发明的优点是以制备的PsY5A抗血清为基础，应用 SPA-ELISA技术，使检测真正做到了简便、快速、灵敏、准确。
具体实施例方式
下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，本发明的试剂盒的 制备方法按常规方法。实例1 用本发明的试剂盒及其鉴定方法对病株进行鉴定的实施例(1)供试样品收集从田间(样品代号和来源见表1)采来的病株，在温室中种植， 采收得到的烟草种子，根据不同的采集地分别记为“种1”、“种2”、“种3”、“种4”，将在温室 接种发病的烟种记为“种5”，健康烟株的种子记为“种6”。(2)供试样品的处理将样品混勻，称取种子5g放入研钵中，加入0. OlM磷酸盐缓 冲液(PBS) 20ml研磨，静置3h 4h，备用。(3)用本发明的试剂盒鉴定(2)中所述的样品处理液，并依如下步骤进行①包被金黄色葡萄球菌A蛋白，其工作浓度为2.5yg/ml，200y 1/孔，4°C过夜；②加入用0. OlM磷酸缓冲液稀释5000倍的一抗，200 μ 1/孔，37°C孵育3h或4°C 过夜，0. OlM PBST洗板5次，5min/次；③加入供试样品处理液，200ul/孔，37°C孵育3h ；④用0. OlM PBST 洗板 5 次，5min/ 次；⑤加入用0. OlM PBS稀释2000倍的二抗，200μ 1/孔，37°C孵育2h或4°C过夜，洗 涤同④)；⑥加入辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白，其工作浓度为1 40，200ul/ 孔，37°C孵育2h或4°C过夜，洗涤同④)；⑦加入四甲基联苯胺底物反应液，100 μ 1/孔，37°C孵育10 20min ；⑧加入2M H2SO4终止反应，50 μ 1/孔，在DG3022型酶联免疫检测仪上读0D450值， Ρ/Ν> 2.0判为阳性。(4)阳性对照为烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci) Y5株系的菌悬 液，菌体浓度为5X108cellS/ml ；(5)空白对照为无菌水。上述鉴定结果见表2。实例2用本发明的试剂盒及其鉴定方法对土样进行■的实施例，除(1)供试样 品不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述，其鉴定结果见表2。(1)供试样品①田间土样每块田采用9点取样法取样、混勻作为一个样品，不同 点采集的样品代号。②温室土样将盆栽烟株的盆中土壤混合取样，样品代号和来源见表
Io实例3用本发明的试剂盒及其鉴定方法对烟株根部残体进行—的实施例，除 (1)供试样品不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述，其鉴定结果见表2。(1)供试样品将田间或温室烟株的根部拔起，弃去土壤部分，不同点采集的样品 样品代号和来源见表1。
表1供试菌株、样品及来源 表2用本发明试剂盒及其鉴定方法鉴定烟草野火病样品的结果野火病样品 「^^明试剂盒及其鉴定方法
权利要求
一种快速鉴定烟草野火病菌的试剂盒，该试剂盒由酶标反应板和相关试剂构成，所述的相关试剂有以下部分(1)抗血清PsY5A，所述的PsY5A抗血清是通过检测菌株的致病性筛选致病力强的烟草野火病Pseudomonas syringae pv.tabaci Y5菌株为抗原，通过免疫注射健康新西兰大耳兔，按照颈动脉放血方法获得；(2)0.05M pH9.6包被缓冲液，所述的包被缓冲液用Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸馏水至1000ml制得；(3)0.01M pH7.4磷酸缓冲液；(4)1×PBST洗涤液，所述的1×PBST洗涤液为吐温-200.5ml加0.01M pH7.4磷酸缓冲液至1000ml；(5)pH5.4的底物缓冲液，其中A液为0.1M柠檬酸2.22ml；B液为0.1MNa2HPO42.78ml加蒸馏水10ml；(6)四甲基联苯胺底物反应液，所述的四甲基联苯胺底物反应液由四甲基亚砜配制成10mg/ml四甲基联苯胺100μl，加入0.65％H2O225μl，再加入上述底物缓冲液至10μl；(7)金黄色葡萄球菌A蛋白纯品及辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白，所述的金黄色葡萄球菌A蛋白纯品的工作浓度为2.5μg/ml，以包被缓冲液先配成1mg/ml母液，4℃贮备；所述的辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白的工作浓度为1∶40；(8)阳性对照物为烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)Y5株系的菌悬液，菌体浓度为5×108cells/ml。
2.根据权利要求1所述的试剂盒对烟草野火病菌的鉴定方法，该方法按以下步骤进行(1)供试样品的处理，将样品混勻，称取种子或烟株组织5g放入研钵中，加入0.01M磷 酸盐缓冲液20ml研磨，静置3h 4h，备用。(2)用所述的快速鉴定烟草野火病菌的试剂盒鉴定(1)中所述的样品处理液，并依如 下步骤进行①包被金黄色葡萄球菌A蛋白，其工作浓度为2.g/ml，200ia/孔，4°C过夜；②加入用0.01M磷酸缓冲液稀释5000倍的一抗，200 u 1/孔，37°C孵育3h或4°C过夜， 0. 01M PBST 洗板 5 次，5min/ 次；③加入供试样品处理液，200ul/孔，37°C孵育3h；④用0.01M PBST洗板5次，5min/次；⑤加入用0.01M磷酸缓冲液稀释2000倍的二抗，200 u 1/孔，37°C孵育2h或4°C过夜， 洗涤同④；⑥加入辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白，其工作浓度为1 40，200ul/孔， 37°C孵育2h或4°C过夜，洗涤同④；⑦加入四甲基联苯胺底物反应液，100u 1/孔，37°C孵育10 20min ；⑧加入2MH2S04终止反应，50 u 1/孔，在酶联免疫检测仪上读0D450值，P/N >2.0判 为阳性。(3)阳性对照为烟草野火病菌(Pseudomonassyringae pv. tabaci) Y5株系的菌悬液， 菌体浓度为5X108cells/ml ；(4)空白对照为无菌水。
全文摘要
本发明公开一种快速鉴定烟草野火病菌的试剂盒及其鉴定方法，属植物病原细菌的免疫测定法技术领域。该试剂盒由酶标反应板和如下相关试剂构成，(1)抗血清PsY5A，(2)0.05M pH9.6包被缓冲液；(3)0.01M pH7.4PBS；(4)1×PBST洗涤液；(5)pH5.4的底物缓冲液；(6)TMB底物反应液；(7)SPA及HRP-SPA(8)阳性对照物为烟草野火病菌株系的菌悬液，菌体浓度为5×108cells/ml。本发明还提供了用该试剂盒进行鉴定的方法。本发明以制备的PsY5A抗血清为基础，应用SPA-ELISA技术，使检测真正做到了简便、快速、灵敏、准确。
文档编号G01N33/569GK101865918SQ200910094349
公开日2010年10月20日 申请日期2009年4月15日 优先权日2009年4月15日
发明者刘雅婷, 姬广海, 张世珖, 彭润, 徐玲, 李永忠, 罗佑珍 申请人:云南农业大学