专利名称：盐霉素elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测盐霉素含量的试剂盒，特别是检测动物源性 食品中盐霉素含量的酶联免疫试剂盒。背景技术：
盐霉素(Salinomycin)属于聚醚类兽用抗生素，对大多数革兰 氏阳性菌和部分霉菌起抗菌作用，单独使用对鸡球虫病能发挥良好的预防效果。但使用盐 霉素不可过量，过量使用将会在动物体内大量蓄积，并会使所食用动物中毒死亡，通过食物 链而危及人类健康。2002年12月我国农业部公告第235号文规定盐霉素在肌肉中最高 残留量为600yg/kg，在皮肤、脂肪中的最高残留量为1200 μ g/kg，在肝中的最高残留量为 WOOyg/kg。欧盟自2006年，不再允许盐霉素-钠在饲料中添加。因此，检测盐霉素在动 物性食品中的残留量非常重要。目前，常用于盐霉素残留检测的方法主要有微生物法和仪器分析法。微生物检测 法虽然经济、操作简便，但在样本中有其他微生物抑制剂存在时，其灵敏度和特异性受到限 制。仪器分析法主要有高效液相色谱分析法(HPLC)、液-质联机(LC-MS)、液质串联质谱法 (LC-MS/MS)等，这些方法的前处理过程繁琐、检测费用较高，不宜用于大量样本筛查，推广 使用受到限制。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的盐霉素 残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术 含量不高，可进行一次连续多个样品中盐霉素残留量的测定，减少了检测样本所需要的时 间。本实用新型的技术方案是一种检测食品中盐霉素残留量的酶联免疫试剂盒，包 括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自 封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯酶标板作为固相载体， 酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反 应微孔条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被盐霉素偶联抗原制成检测板，放 入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，以塑料硬膜为盖板膜，将6瓶Iml梯度浓度的标准品溶液、 Iml高浓度标准品溶液、12ml酶标二抗、7ml盐霉素抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液 B液、7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和 玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质检报告一同封 装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准 分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回 铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的盐霉素 将和酶标板微孔条上预包被的盐霉素偶联抗原竞争抗盐霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB 底物显色，样本吸光度值与样本中所含盐霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其 对应的稀释倍数，即可得出样品中盐霉素含量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度肌肉/肝脏样本的最低检测限为5 μ g/ kg、蛋类样本的最低检测限为20 μ g/kg;肌肉/肝脏样本的回收率为75% 士 10% ；蛋类样 本的回收率为80% 士20%;相对于其他盐霉素检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、氮气吹干装置、涡旋仪、离心机、振荡机和微量加样器等，同类实验室一般均有配备， 所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于盐霉素残留量的检测。
图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶联板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。
具体实施方式
参见附图酶标反应微孔条(2)预包被盐霉素偶联抗原(3)固定于酶标板的外框 支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱 内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透 明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装 50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽(6) 的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封 装7ml终止液，红色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色塑料 试剂瓶(8)用于封装7ml盐霉素抗体工作液，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装Iml/ 瓶的标准品溶液及Iml高浓度标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次 为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液(11)，7ml显色液A液瓶位(14)，7ml显色 液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml盐霉素抗体工作液瓶位(16)，12ml酶标二抗瓶 位(15)，6种Iml/瓶各种浓度的标准品溶液及1瓶Iml高浓度标准品溶液瓶位(17)，盒体 为(19)是硬纸盒。本实用新型的实施例一、样本的前处理1.配液:配液1:8%氯化钠溶液称取8. Og氯化钠加去离子水溶解定容至IOOml 配液2 甲醇-8 %氯化钠溶液量取80ml甲醇加入到20ml 8%氯化钠溶液中混勻配液3 :0. 5M氢氧化钠-8%氯化钠溶液称取2. Og氢氧化钠加8%氯化钠溶液溶解定容至IOOml配液4:复溶工作液用去离子水将2X浓缩复溶液按1 1体积比进行稀释(1份2X浓缩复溶液+1 份去离子水)用于提取样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。[0027]配液5 洗涤工作液用去离子水将20X浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释(1份20X浓缩洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2. (a)肌肉、肝脏样本处理步骤取适量样本用勻浆机4000r/min以上勻浆Imin ；称取2. 0 士0. 05g均质物至50ml 聚苯乙烯离心管中，加入8ml甲醇-8%氯化钠溶液，用振荡器剧烈振荡5min ；3000g以上， 室温(20-25°C )离心IOmin ；移取2ml上清液加入4ml 0. 5M氢氧化钠氯化钠溶液混 合，再加入IOml 二氯甲烷，用振荡器振荡5min，3000g以上，室温(20-25°C )离心IOmin ；除 去上层，取下层5ml至IOml干净的玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；用Iml复 溶工作液溶解干燥的残留物；取50 μ 1用于分析。(b)蛋类样本处理步骤将蛋清与蛋黄搅拌均勻；量取Iml均质过的蛋样本至IOml刻度离心管中，加入 5ml乙腈，用振荡器充分振荡5min，3000g以上，室温(20-25°C )离心IOmin ；取上层清液 Iml至IOml干净的玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml复溶工作液，涡 动30s ；取出200 μ 1加入600 μ 1复溶工作液混勻；取50 μ 1用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20_25°C )平衡30min以上，注意每种 液体试剂使用前均须摇勻。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记 录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品工作液/样本溶液加标准品工作液/样本溶液50 μ 1到对应的微孔 中，再加入抗体工作液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置于25°C避光环境中反 应 30min。6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ 1/孔，充分洗涤 4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、加酶标二抗加入酶标二抗100 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置25°C 避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6。 8、显色加入底物液A液50 μ 1/孔，再加底物液B液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用 盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。9、测定加入终止液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于450nm处(建议用双 波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与盐霉素含量成负相关。1、用样本的平均吸光度值与标准品吸光度值比较即可得出其浓度范围(μ g/L)。 假设样本ι的吸光度值为0. 611，样本2的吸光度值为1. 012，标准液吸光度值分别是 0 μ g/L 为 1. 889 ； 1 μ g/L 为 1. 391 ;3 μ g/L 为 0. 947 ；9 μ g/L 为 0. 483 ；27 μ g/L 为 0. 225 ；81 μ g/L为0. 080。则样本1的浓度范围是3 μ g/L-9 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即可 得出样本中盐霉素残留的浓度范围；样本2的浓度范围是1 μ g/L-3 μ g/L再乘以其对应的 稀释倍数即可得出样本中盐霉素残留的浓度范围。2、定量分析(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) =- χ 100%
B0B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值BO-O μ g/L标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以盐霉素标准品浓度(μ g/L)的半对数为横坐 标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应 的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中盐霉素实际含量。四、测定前的注意事项1、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20-25°C )会导致所有标准的OD值 偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性 不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需将其摇勻。4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试 剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中 的试剂。6、储存条件保存试剂盒于2_8°C，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标 准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630nm)值 小于0. 5 (A450nm < 0. 5)时，表示试剂可能变质。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色10-15min即可。若颜色较浅，可 延长反应时间到20min(或更长)，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。9、该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度 发生变化。
权利要求一种盐霉素ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被盐霉素偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别6瓶标准品溶液、1瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用白色帽 的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料 瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液 用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽 的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔 预包被盐霉素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，Iml/瓶， 浓度分别为ο μ g/L，1 μ g/L，3 μ g/L，9 μ g/L，27 μ g/L，81 μ g/L ；高浓度标准品溶液1瓶， Iml ；酶标二抗1瓶，12ml ；抗体工作液1瓶，7ml ；显色液A液1瓶，7ml ；显色液B液1瓶， 7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1瓶，40ml ；浓缩复溶液1瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测动物源性食品中盐霉素含量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、盐霉素抗体工作液、盐霉素6个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、高浓度标准品、浓缩复溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的盐霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗盐霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中盐霉素的含量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在动物源性食品中盐霉素的含量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/52GK201628716SQ200920173198
公开日2010年11月10日 申请日期2009年8月28日 优先权日2009年8月28日
发明者万宇平, 何方洋, 余厚美, 冯才伟, 冯才茂, 刘玉梅, 李勇, 汪善良, 罗晓琴, 蒲晓容, 赵正苗 申请人:北京望尔康泰生物技术有限公司;北京望尔生物技术有限公司