人n端b型利钠肽原免疫分析试剂盒及其制备方法

专利名称：：人n端b型利钠肽原免疫分析试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种人N端B型利钠肽原(Nt-proBNP)化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：心血管疾病无论在我国或者在全球，都是严重威胁人类生命和健康的重要疾病。世界卫生组织在2004年9月26日第5个“世界心脏日”时，在日内瓦发表的一份公报中指出，全球每年有1700万人死于心脏病和其他心血管疾病，约占全球死亡人数的1/3，预计到2020年这个数字将突破2000万，心血管疾病和中风将成为人类死亡和致残的首要原因。其中，心力衰竭(心衰，HeartFailure,HF)是严重危害人类健康的心血管疾病中的一种病理综合征，如今已不再被简单地看作是独立的临床疾病，而是作为心血管疾病发展到后期的一个阶段。从始发危险因子(高血压、高胆固醇血症、糖尿病)到左心室肥大、心肌细胞功能紊乱、冠心病，最后发展成为心力衰竭。2003年，中国心血管健康多中心合作研究组应用四阶段整群随机抽样方法，在中国10省市抽样调查，结果显示心衰患病率为0.9%，随着年龄增高，心衰患病率显著上升，北方明显高于南方(1.4%Vs0.5%)，女性略高于男性(1.0%Vs.0.9%)o由于我国冠心病和高血压发病仍呈上升趋势，人口老龄化趋势明显，HF正成为我国心血管领域的重要公共卫生问题。在发达国家，HF是一种常见情况，影响着2%的人口，并且有着很高的死亡率，特别是在老年患者中。有学者统计，心力衰竭患者一旦出现典型症状，5年存活率男性为25%，女性为38%，与恶性肿瘤病人相仿。目前慢性心脏衰竭在70岁以上老年人群中的发病率约为10%以上。有资料显示，由于饮食习惯的改变等原因，中国目前有2亿人超重、7000万人肥胖，高血压和高血脂的人数都超过1.6亿，所有这些，导致了中国的冠心病、中风等心血管疾病患者呈爆发性增长。在发达国家，约有7%的人群患有此病，但只有2%的人被诊断出来，还没有特异的生化参数和治疗监测方法。HF的不良预后，使越来越多的学者开始考虑应打破传统的观念，于尚未出现明显“充血性”症状之前就着手干预治疗，从根本上防治HF，延缓HF发展进程，提高患者的远期存活率。HF尽早发现是非常重要的，因为，如果被发现得早，通常它是能用药物控制的。因此，对心衰的预防和及时正确的诊断和治疗非常重要。传统根据病史和体征对心衰患者的诊治及长期监控是非常不完善的，常需住院来调节体液的潴留。如果有一个能有效监控心衰的生化标志物应用于临床诊断，那将是非常有效的。因此，心脏生物化学标志物的准确有效的应用，显得更加重要。目前研究证实，脑利钠肽或B型钠尿肽(brainnatriureticpeptide,B-typenatriureticpeptide；BNP)或非活性的脑利钠肽肽原N末端(NT-ProBNP)是较好的心衰标志物，能反映心室容积扩大、心室超负荷和心脏功能有无损伤及损伤程度。早在2000年“Heart”杂志在一篇名为“BNP:很快成为治疗心衰患者的常规措施”的编者评论中就明确认为BNP有助于诊断心衰，可作为心衰患者预后标志物，是一种较新的监控心衰的方法。BNP是一种钠尿肽，由心室分泌的类肽化合物，具有利钠、利尿、舒血管、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统的作用。研究表明容量负荷引起的心室压力改变以及室壁张力的增加是刺激BNP分泌的因素。BNP是含有32个氨基酸残基的多肽，是从氨基酸前体蛋白(pro-BNP)中的羧基端裂解而来，同时产生76个氨基酸非活性的N端B型利钠肽原(NT-proBNP)，在血中浓度随BNP升高而升高。MuellerT与Hervas等研究发现血浆BNP、NT-proBNP浓度的升高对于心衰的诊断具有很高敏感性，可作为心力衰竭诊断的敏感指标，并能评估心功能损害严重程度。NT-proBNP和含有C端32个氨基酸的具有生物活性的BNP是等摩尔释放，因此二者在心血管系统疾病的诊断、治疗监测和预后方面有着相似的临床应用。但与BNP相比，NT-proBNP因其半衰期长(半衰期为120min)、心衰时升高幅度大而更有利于临床应用。美国FDA在2000年11月22日首次批准了BiositeDiagnostics公司用于帮助诊断充血性心力衰竭的BNP试剂盒“BiositeDiagnosticsTriageBNP”。这是一种床旁检验(POCT)，使用六滴全血或血浆可在15分钟完成此项检测。如以100pg/ml为诊断心衰判断值时，特异性为95.6%，灵敏度为82.4%。与纽约心脏学会(NYHA)的心衰功能分级分相比，发现BNP的检验具有敏感、准确、快速的特点，能够准确地反映心衰的严重程度，并与心衰的功能分级有良好的相关性，而且更能诊断出早期的心脏功能紊乱。早期实验的研究对象多是急诊室呼吸困难、肺病、心脏病患者，结果显示BNP、NT-proBNP与心衰具有很好的相关性，有些心力衰竭患者BNP正常，阳性预测值达到90%-95%，其阴性预测能力更具有诊断价值。当急性心力衰竭出现左室充盈压增加的临床综合征以及如缺血、肺栓塞等任何导致肌细胞伸展的情形，检验NT-proBNP非常有益，同时对于鉴别呼吸困难是否为心源性原因具有重要意义，优于常规临床判断。另外，NT-proBNP还能辅助判断进展期心衰患者的预后，以及对左心室功能不全的治疗进行监测和指导。2000年前后，国际上已经认定NT-proBNP是测定心衰的一个具有划时代意义的特异性标志物。2002年11月19日，FDA批准上市NT-proBNP，一种用于实验室帮助诊断充血性心力衰竭(congestiveheartfailure)的新的酶联免疫检测试剂盒。这种检测试剂，ElecsysproBNP测定(ElecsysproBNPImmunoassay)，是由印地安纳州Indianapolis的罗氏诊断学公司(RocheDiagnostics，Inc)制造的。FDA批准这种检验试剂是基于生产厂商在美国和欧洲16个医学中心对2000多位健康和病患男女进行的临床研究。此项研究显示充血性心力衰竭症状的严重性与NT-proBNP的水平有关。目前，国内的医院使用的同类产品，全部依赖进口，而且国际上只有少数几家公司拥有此项技术。如前所述，NT-proBNP作为一种良好的心肌标志物已经获得临床认可，得到广泛的应用，但由于目前的相关检测试剂依赖进口，导致患者使用成本相对较高，进口的NT-proBNP的ELISA检测试剂盒的价格为7200元人民币/96次检测、RIA检测试剂盒的价格为9800元/125次检测。通过检索，国内尚未见到NT-proBNP检测试剂相关专利及新药申报，因此，自主研发具有知识产权的特异性NT-proBNP单克隆抗体，生产我国自己的NT-proBNP检测试剂，改变目前依赖国外进口产品的状况，具有非常重要的现实意义。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。其中技术工艺成熟，具有先进性且实用性强，易于推广的主要有放射免疫分析、酶免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和化学发光免疫分析等四种。这些超微量检测技术的基本理论大体相同，但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同。根据大量的试验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，依次为化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析方法存在诸多缺点，如操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵寸。化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，然而，目前化学发光免疫分析技术在NT-proBNP免疫分析产品的高效性和稳定性方面存在问题。另一方面，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒均为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。
发明内容本发明解决了上述问题，即将化学发光技术与NT-proBNP的免疫分析学有效地结合，提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测NT-proBNP的试剂盒，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。本发明的其中一个目的是提供一种人N端B型利钠肽原(NT-proBNP)化学发光免疫分析定量测定试剂盒。本发明的另一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。根据本发明的试剂盒包括1)人N端B型利钠肽原校准品；2)包被有人N端B型利钠肽原的多克隆抗体的载体；3)酶标记的人N端B型利钠肽原的单克隆抗体；以及4)上述酶所作用的化学发光底物。进一步，根据本发明的制备上述试剂盒的方法包括以下步骤1)以重组人N端B型利钠肽原纯品配制人N端B型利钠肽原校准品；2)用酶标记人N端B型利钠肽原的单克隆抗体；3)以人N端B型利钠肽原的多克隆抗体包被载体；4)分装上述人N端B型利钠肽原校准品、酶标记的人N端B型利钠肽原的单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物；以及5)组装为成品。在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中，所述载体可为固相载体，优选为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。所述酶可以为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。所述化学发光底物可以为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，其中所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2_二氧乙烷、3-(2:螺旋金刚烷)-4_甲氧基-4-(3”_磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。根据本发明的方法中，其中所述包被载体的步骤3)包括以下步骤1)包被基于IOOOmL所述包被液包含10.60g的碳酸钠，配制包被液，所述包被液的pH值为9.4-9.6，然后将制备的包被液与人N端B型利钠肽原的多克隆抗体混合，并将所得混合液负载于载体上；2)用生理盐水洗涤上述载体；以及3)封闭基于1000mL所述封闭液包含0.2gNaH2P042H20,2.9gNaH2P0412H20、lOg胰蛋白胨、和lmL生物防腐剂，配制封闭液，所述封闭液的pH值为7.0-7.5，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的载体上。具体的上述试剂盒可以包括人N端B型利钠肽原校准品、抗体包被板、酶标记物与化学发光底物液、20倍浓缩洗涤液等。其中，所述人N端B型利钠肽原校准品为标准级，纯度不低于90%、抗体包被板为48孔或96孔的微孔条、酶标记人N端B型利钠肽原单抗为偶联辣根过氧化物酶、化学发光底物液为鲁米诺、浓缩洗涤液为Tris-HCl(含Tween20)。本发明“人N端B型利钠肽原化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以特异地定量检测出病人标本中人N端B型利钠肽原的含量，可以根据人N端B型利钠肽原含量的多少判断是否发生心衰以及对心脏功能进行评价。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。该人N端B型利钠肽原测定试剂盒(化学发光法)的各项指标均达到酶联免疫分析法的标准。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒，酶标记的人N端B型利钠肽原单抗与载体上包被的人N端B型利钠肽原多抗和被测样品的人N端B型利钠肽原抗原形成“双抗体夹心”结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。另外，这种模式还便于操作和生产。本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高，比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约10倍，可为心衰及其它相关心脏疾病的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明根据下。图1为本发明组装成的板式NT-proBNP化学发光定量检测试剂盒，其中包含以重组人N端B型利钠肽原纯品配制人N端B型利钠肽原校准品；用酶标记人N端B型利钠肽原的单克隆抗体；以人N端B型利钠肽原的多克隆抗体包被载体；分装上述人N端B型利钠肽原校准品、酶标记的人N端B型利钠肽原的单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物、洗涤液、使用说明等；图2为本发明在使用时在威海威高集团的JR-1型发光仪上检测，同时在该仪器上直接完成数据处理及结果分析；图3为正常人人N端B型利钠肽原含量及临界值的确定，其中168例健康人血清，求得的平均值为44.96pg/ml，标准偏差为25.93pg/ml，计算的平均值加上2.7倍的标准偏差所对应的浓度值作为临界值，结果为114.96pg/ml；图4为本发明与Roche的电化学发光检测试剂盒相关性比较结果从重庆第三军医大学西南医院收集的血清标本使用本发明的“人N端B型利钠肽原化学发光定量检测试剂盒”和Roche的电化学发光检测试剂盒检定量检测血清标本234份，并经统计学处理结果表明，该两种方法检测的结果高度相关，相关系数r=0.9459；图5为检测灵敏度的测定结果选择已知浓度样本(21000pg/ml)，用临床确定阴性血清倍比稀释，检测结果表明该发明检测下限<100pg/ml，上限接近30000pg/ml，能满足临床人N端B型利钠肽原的检测需要。具体实施例方式实施例1制备发明的板式N端B型利钠肽原定量检测试剂盒一、抗NT-proBNP抗体的制备将本实验室重组表达的NT-proBNP蛋白(公开于公开号为CN101230101A的专利申请中)从-80°C冰箱取出，溶解后过滤，Lowry法测定蛋白含量，用pH5.8的20mmol/LPBS将其稀释到0.5mg/ml。选取10只6周龄、体重约20g的雌性Balb/c小鼠。抗原乳化选用双注射器互推法。首次免疫时，将重组表达的NT-proBNP蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合，每只小鼠按100ugNT-proBNP的量皮内多点加腹腔注射。第14和第28天分别进行第二次第三次免疫，佐剂改用不完全弗氏佐剂，抗原量、注射体积和途径不变，第3次免疫后间接ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂的lOOygNT-proBNP，3天后细胞融合。筛选的阳性克隆经多次克隆化稳定后，采用腹水法制备纯化单抗，抗体经亚类鉴定、特异性分析、表位鉴定及亲和力测定后选择位于N端的高亲和力抗体备用。本发明通过生物信息学分析，综合考虑蛋白质的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，综合蛋白分子的糖基化情况预测与上述单抗最佳配对的线性表位序列，采用多肽合成及偶联BSA的方式获得免疫原(选择NT-proBNP氨基酸序列C端约15个氨基酸送上海吉尔生化委托合成，纯度>95%，并偶联BSA的方式获得免疫原)，免疫新西兰大白兔，经过多次免疫，待兔血清中的抗NT-proBNP抗体达到较高效价后放血，经过抗原亲和层析纯化后得到了高效价、高亲和力的NT-proBNP特异性的多克隆抗体。二、酶标记抗体制备将上述一中制备的NT-proBNP单克隆抗体用改良高碘酸法标记辣根过氧化物酶，用PBS充分透析后加入等体积甘油和防腐剂在-20°C分装保存。三、NT-proBNP校准品的制备用重组NT-proBNP纯品(公开于公开号为CN101230101A的专利申请中)配置，设置0、100、500、2500、10000、30000pg/ml共6瓶。四、酶标抗体浓度选定采用方阵法(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)选择酶标抗体的最佳工作浓度大于15000(大约0.2-0.5ug/ml)五、固相包被板的制备(1)包被无水碳酸钠10.60g充分溶解后，用盐酸调整pH至9.4-9.6，加入适量NT-proBNP多克隆抗体(至终浓度为1.5yg/ml)，然后加入微孔板各孔中，每孔100ia，4°C24小时。(2)洗涤用生理盐水在Bio-RAD洗板机上洗涤一次。7(3)封闭封闭液配方NaH2P042H200.2gNaH2P0412H202.9g胰蛋白胨lOgProclin300lmL双蒸水定容至lOOOmL将上述试剂称量好放入清洁容器中，加双蒸水定容，混勻后调节pH为7.0。将包被好的ELISA板每孔加满封闭液，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气，如果有漏气需要重新封袋。置2-8°C保存。六、酶标抗体稀释液的配制Tris12.120g小牛血清10mlProclin300lmL双蒸水定容至lOOOmL将上述试剂称量好放入清洁容器中，加双蒸水定容，混勻后调节pH为7.4。七、化学发光底物液A液Tris0.2mMLuminol0.15mM羟基香豆素0.59mM没食子酸0.35mMB液氨基酸氧化酶0.85mMDTPA0.5mM维生素C0.12mM乙酸-乙酸缓冲液200mMTween20(V/V)0.8%八、20X洗涤液Tris24.240gNaCl160gKC14gHC115mlTween2020ml去离子水定容至1000ml调节pH7.4左右。九、半成品及成品组成上述步骤所得产品分装即为半成品，批量制备后用于考察试剂盒的特异性度、精密度及稳定性，合格才能组装成NT-proBNP定量检测试剂盒成品。实施例2制备本发明的管式人N端B型利钠肽原定量检测试剂盒除以辣根过氧化物酶标记的NT-proBNP单抗，以相同条件准备化学发光底物、包被液及封闭液，只是选用以塑料珠和塑料管为载体，其余均以与实施例1相同的方法制备人N端B型利钠肽原定量检测试剂盒。实施例3制备本发明的基于磁微粒子的人N端B型利钠肽原定量检测试剂盒除以磁性颗粒作为载体外，其余均与以实施例1相同的方法制备人N端B型利钠肽原定量检测试剂盒。实施例4本发明的板式人N端B型利钠肽原定量检测试剂盒的使用方法以上实施例1制备的板式人N端B型利钠肽原定量检测试剂盒的具体操作如下1)试剂盒保存于4°C冰箱中，使用前取出室温平衡15分钟。2)取出包被板条，插入板条架中。3)反应孔中分别加各浓度校准品，每孔分别加0、100、500、2500、10000、30000pg/ml各50iil，每孔加酶标记物50iU，用微量震荡器充分振荡混勻，37°C温育1小时。4)甩去反应液，每孔加满稀释液后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。5)各孔加化学发光底物液100iil，用微量震荡器充分振荡混勻，室温避光反应5分钟。6)在加化学发光底物液后的第5分钟后，在化学发光测量仪依序测定各孔的发光强度(RLU)。7)以校准品浓度为横坐标，发光强度(RLU)值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的NT-proBNP的浓度。实施例5本发明的板式人N端B型利钠肽原定量检测试剂盒的方法学鉴定按照本领域中常规的制造及检定规程(请提供引用出处)(参考2000版《中国生物制品规程》中有关体外诊断试剂的制检规程格式，主要包括以下几个方面1.定义、组成及用途。2.制造包括基本要求、专用原材料和制造程序。3.半成品检定。4.成品检定。5.保存及有效期。)对实施例1中制备的试剂盒进行检定，相关结论见下表1:表1试剂盒总体评价<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>选择已知浓度样本(21000pg/ml)，用临床确定阴性血清倍比稀释，检测结果如下表2检测灵敏度测定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结论说明板式人N端B型利钠肽原化学发光定量检测试剂盒的准确性、特异性、灵敏度和稳定性完全合格，并达到临床人N端B型利钠肽原检测的要求。实施例6正常人人N端B型利钠肽原含量及临界值的确定随机取168例健康人血清用实施例13中制备的“人N端B型利钠肽原化学发光定量检测试剂盒”测定结果如下168例健康人血清，测得NT-proBNP平均值为44.96pg/ml，标准偏差为25.93pg/ml,以平均值加上2.7倍的标准偏差所对应的浓度值作为临界值，结果为114.96pg/ml。实施例7本发明的板式人N端B型利钠肽原定量检测试剂盒与Roche的电化学发光检测试剂盒比较从重庆第三军医大学西南医院收集经Roche的电化学发光检测试剂盒检测过的血清标本，使用实施例1的板式人N端B型利钠肽原化学发光定量检测试剂盒检测，以比较两种试剂盒的相关性。一、临床血清标本的来源从重庆第三军医大学西南医院收集正常人血清168份，Roche的电化学发光检测试剂盒检定量检测过的血清标本234份。二、使用板式人N端B型利钠肽原定量检测试剂盒与Roche的电化学发光检测试剂盒比较1、方法所有收集的血清标本使用本发明实施例1的“人N端B型利钠肽原化学发光定量检测试剂盒”(按说明书操作)和Roche的电化学发光检测试剂盒检定量检测血清标本234份，并经统计学处理结果表明，该两种方法检测的结果高度相关，结果如图3-5。2、结果人N端B型利钠肽原化学发光定量检测试剂盒JR-1型发光仪上测试，与Roche的电化学发光检测结果对照见表3:表3234例临床样本NT-proBNP检测结果编号罗氏(Pg/ml)本发明(Pg/ml)编号罗氏(pg/ml)本发明(pg/ml)1742.474211810680576222797279011930572883339865268120546350504365.6727121330446465106604140122809.41070627.8571231236136571301113000124325631758954.869112584.243511<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>①符合率分析以本发明测定的临界值为标准，判断阳性和阴性，将检测结果对照见表4表4234例临床样本NT-proBNP检测结果符合率统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>阳性符合率=205/206X100%=99.51%；阴性符合率=28/29X100%=96.6%；总符合率=(205+28)/234X100%=99.5%。(P<0.01)结论本发明与Roche的电化学发光试剂盒检测同样样本的比较结果，两种方法均高度相关，P均值<0.01。说明两种方法均有同等的使用价值。上述结果表明试剂盒的各项指标均达到试剂盒的标准并满足了NT-proBNP临床检测的需求。相对于目前国内进口使用的Roche的电化学发光试剂盒，具有相同的检测效果，但不需要昂贵的全自动化检测分析仪，试剂成本低廉的优势，适合在国内普及推广。虽然本发明已以较佳实施例披露根据上，然其并非用以限定本发明，任何所属
技术领域：
的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。权利要求一种人N端B型利钠肽原免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)人N端B型利钠肽原校准品；2)包被有人N端B型利钠肽原多克隆抗体的载体；3)酶标记的人N端B型利钠肽原的单克隆抗体；4)上述酶所作用的化学发光底物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，2)中所述载体为固体载体。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述固体载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，3)中所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，4)中所述化学发光底物为1，2_二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，所述1，2_二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2_二氧乙烷、3--螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-、-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。6.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤1)以重组人N端B型利钠肽原纯品配制人N端B型利钠肽原校准品；2)用酶标记人N端B型利钠肽原的单克隆抗体；3)以人N端B型利钠肽原的多克隆抗体包被载体；4)分装人N端B型利钠肽原校准品、酶标记的人N端B型利钠肽原单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物；以及5)组装为成品。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3)所述的包被载体包括以下步骤1)包被基于IOOOmL所述包被液包含10.60g的碳酸钠，配制包被液，所述包被液的pH值为9.4-9.6，然后将制备的包被液与人N端B型利钠肽原的多克隆抗体混合，并将所得混合液负载于载体上；2)用生理盐水洗涤上述载体；3)封闭基于IOOOmL所述封闭液包含0.2gNaH2PO42H20，2.9gNaH2PO412H20、IOg胰蛋白胨、和ImL生物防腐剂，配制封闭液，所述封闭液的pH值为7.0-7.5，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的载体上。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物为1，2_二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，所述1，2_二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2_二氧乙烷、3-(2:螺旋金刚烷)-4_甲氧基-4-(3”_磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本发明提供一种人N端B型利钠肽原免疫分析试剂盒，其主要包括1)人N端B型利钠肽原校准品；2)包被有人N端B型利钠肽原多克隆抗体的载体；3)酶标记的人N端B型利钠肽原的单克隆抗体；4)上述酶所作用的化学发光底物。本发明还提供上述试剂盒的制备方法。根据本发明的试剂盒，酶标记的人N端B型利钠肽原单抗与载体上包被的人N端B型利钠肽原多抗和被测样品的人N端B型利钠肽原抗原形成“双抗体夹心”结构，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。另外，本发明的试剂盒可应用于开放式的化学发光测量仪，使用成本低，更易推广应用。文档编号G01N33/577GK101819205SQ20101019086公开日2010年9月1日申请日期2010年6月3日优先权日2010年6月3日发明者易维京,胡川闽,贾向阳,陈安申请人:中国人民解放军第三军医大学