专利名称：手足口病生物素荧光法检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测试剂盒，具体是一种针对柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型病 毒的手足口病生物素荧光法检测试剂盒。
背景技术：
手足口病是由多种肠道毒引起的传染病，多发生于婴幼儿。由于其主要临床表现 是发热和手、足、口腔等部位出现疱疹，因此被称为手足口病。可引起手足口病的肠道病毒 很多，有柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，肠道病毒71型病毒(EV71型病 毒)等多达20多种。这些病毒尽管都可引起相同的疱疹症状，但其临床症状、并发症、病死 率却相差悬殊，从每年流行的趋势看，柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型最常见，其中以肠病 毒71型引起的手足口病最为严重，常发生心肌炎、肺水肿、脑膜炎、脊髓灰质炎样瘫痪等并 发症，严重者导致死亡，肠病毒在病毒学上的分类是属于微小RNA病毒科(picornaviridae)中的肠病毒 群(enterovirus)。EV 71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒，但其感染性强且致病率高， 尤其是神经系统方面的并发症。鸡胚分离培养是检测肠道病毒71型病毒是经典的、准确、敏感的病原学诊断方 法，可以作为金标准，特异性和敏感度均可以达到100%。病毒中和试验(NT)作为经典方 法实验操作繁琐，临床难以应用。血凝和血凝抑制试验用于鉴定病毒、检测血清中的抗体水 平。病毒分离培养和血凝抑制试验经常作为评价新的检测AIV方法的对照。PCR检测方法 临床实验室为常用的检测方法，但实验室条件要求高。基因芯片法是将PCR获得的cRNA肠 道病毒71型病毒固化于芯片，利用核酸探针技术构建的检测肠道病毒71型芯片平台，标记 的核酸探针与靶RNA杂交，可以进一步鉴别混合体系中扩增产物。特异性好，全部检测过程 不超过证。发明内容本实用新型就是为了解决柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型病毒引起手足口病的 快速检测问题，而提供一种手足口病生物素荧光检测试剂盒。本实用新型是基于将生物素-链霉亲和素系统引入荧光检测系统，能明显提高敏 感性和降低背景。利用该系统的放大效应和荧光的优点，不需显色即可直接观察。常用的 荧光素仍然是异硫氰酸荧光素(FITC)。FITC在495nm激发，在525nm发射荧光，呈绿色荧 光。将链霉亲和素-生物素系统引入荧光系统，能明显提高敏感性和降低背景。本实用新型是按以下技术方案设计的。一种手足口病生物素荧光检测试剂盒，包括矩形盒体及盒盖，而在盒体一侧长边 内形成有插孔的试剂架上分别容纳肠道病毒71型病毒抗体试剂瓶，肠道病毒71型病毒生 物素化二抗试剂瓶，柯萨奇病毒A16病毒抗体试剂瓶，柯萨奇病毒A16病毒生物素化二抗试 剂瓶，异硫氰酸荧光素的链霉亲和素试剂瓶、正常兔血清封闭液瓶，以及磷酸甘油缓冲液封片剂瓶；盒体内的纵向分隔板一侧形成卧置缓冲液瓶的空间，而分隔板另一侧形成存储分 区载玻片的空间。这样设计的本实用新型，能同时检测手足口病的肠道病毒71型病毒和柯萨奇病 毒A16两种常见病毒，具有简便、快速、易于判断的特点。
图1是本实用新型立体结构示意图；图2是本实用新型中玻片结构示意图。图中；1.盒体2.盒盖3.插孔4.试剂架5.肠道抗体试剂瓶6.肠道二抗试剂瓶7.柯萨奇抗体试剂瓶8.柯萨奇二抗试剂瓶9.亲和素试剂瓶10.兔血清封闭液瓶11.封片剂瓶12.分隔板13.缓冲液瓶14.载玻片15.肠道病毒检测区16.柯萨奇病毒测试区17a. 17b.反应凹槽18.盖玻片19.减振架。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本实用新型进行详细的说明。一种手足口病生物素荧光检测试剂盒，包括矩形盒体1及盒盖2，而在盒体1 一侧 长边内形成有插孔3的试剂架4上分别容纳肠道病毒71型病毒抗体试剂瓶5，肠道病毒71 型病毒生物素化二抗试剂瓶6，柯萨奇病毒A16病毒抗体试剂瓶7，柯萨奇病毒A16病毒生 物素化二抗试剂瓶8，异硫氰酸荧光素的链霉亲和素试剂瓶9、正常兔血清封闭液瓶10，以 及磷酸甘油缓冲液封片剂瓶11 ；盒体1内的纵向分隔板12 —侧形成卧置缓冲液瓶13的空 间，而分隔板12另一侧形成存储分区载玻片14的空间。载玻片14是连同小包装纸袋一并 存储的。所述手足口病生物素荧光检测试剂盒，其分区载玻片14面上的中心标记线一侧 是肠道病毒71型病毒检测区15，另一侧是柯萨奇病毒A16病毒测试区16，每侧分别按一 定间距对应形成有3个形状相同的反应凹槽17a、17b。所述手足口病生物素荧光检测试剂盒，每侧分别形成肠道病毒检测区和柯萨奇病 毒测试区的的文字标示，以及对应反应凹槽17a、17b形成的阴性对照、阳性对照和待检病 毒的文字标示。图中所示的18是盖玻片，19是盒体1内弯折形成的空心减振架。下面简述应用本实用新型进行的生物素荧光检测过程。生物玻片的制作应用咽拭子擦拭疑似手足口病患者咽部上皮细胞，应用生理盐 水洗涤，留取上皮细胞，然后放入IOml pH 7. 4磷酸盐缓冲液(PBS)中，挤出海绵吸附的细 胞，悬液800g离心5min，弃去上清液，再洗一次，继续用IOml PBS-T缓冲液0. 5% (V/V) TritonX-IOOPBS混悬，静置lOmin，800g离心5min，用PBS调整细胞数至100个/μ 1。点片 到含有多聚赖氨酸载玻片14上的待检病毒反应凹槽17b内，冷风吹干后，56°C烘干杀死病，密封，同时在相应测试区反应凹槽17a内制作正常阴性对照和阳性对照，-700C 低温保存。 免疫荧光检测法生物玻片放置室温后，滴加O.Olmol/L PBSl 10稀释的正常兔 血清封闭液，室温20min。甩去多余的液体不洗。在EV71型检测区15的反应凹槽17a内 滴加1000 μ 1 0. 01mol/L PBS适当稀释的EV71单克隆抗体一抗IgM，20-37°C l_2h或4°C 过夜，0. 01mol/L PBS 洗 2min 3 次；滴加 1000 μ 1 0. 01mol/L PBSl 100 稀释的和一抗相 对应的生物素化抗体二抗，在柯萨奇病毒A16型测试区16的反应凹槽17a内滴加1000 μ 1 0. 01mol/L PBS适当稀释的柯萨奇病毒A16单克隆抗体一抗IgM，20-37°C 1- 或4°C过夜， 0. 01mol/L PBS 洗 2min 3 次；滴加 1000 μ 1 0. 01mol/L PBSl 100 稀释的和一抗相对应 的生物素化二抗，20-370C l-2h, 0. Olmol/LPBS 洗 2min 3 次；滴加 1000 μ 1 0. Olmol/LPBS 1 100 稀释的 SABC-FITC，20-37°C l-2h,0. 01mol/L PBS 洗 2min4 次；封片剂封片，荧光 显微镜10X40倍视野下观察；FITC在490-495nm激发，在520-530nm发射荧光，呈黄绿色。 通过与阴性和阳性对照比较，即可判断出柯萨奇病毒A16或EV71型病毒感染。
权利要求1.一种手足口病生物素荧光检测试剂盒，包括矩形盒体(1)及盒盖O)，其特征在于 盒体(1) 一侧长边内形成有插孔C3)的试剂架(4)上分别容纳肠道病毒71型病毒抗体试剂 瓶(5)，肠道病毒71型病毒生物素化二抗试剂瓶(6)，柯萨奇病毒A16病毒抗体试剂瓶(7)， 柯萨奇病毒A16病毒生物素化二抗试剂瓶(7)，异硫氰酸荧光素的链霉亲和素试剂瓶(9)、 正常兔血清封闭液瓶(10)，以及磷酸甘油缓冲液封片剂瓶(11)；盒体(1)内的纵向分隔板 (12) —侧形成卧置缓冲液瓶(1 的空间，而分隔板(1 另一侧形成存储分区载玻片(14) 的空间。
2.根据权利要求1所述手足口病生物素荧光检测试剂盒，其特征在于分区载玻片 (14)面上的中心标记线一侧是肠道病毒71型病毒检测区(15)，另一侧是柯萨奇病毒A16 病毒测试区(16)，每侧分别按一定间距对应形成有3个反应凹槽(Ha、17b)。
专利摘要本实用新型公开了一种手足口病生物素荧光检测试剂盒，它包括矩形盒体及盒盖，而在盒体一侧长边内形成有插孔的试剂架上分别容纳肠道病毒71型病毒抗体试剂瓶，肠道病毒71型病毒生物素化二抗试剂瓶，柯萨奇病毒A16病毒抗体试剂瓶，柯萨奇病毒A16病毒生物素化二抗试剂瓶，异硫氰酸荧光素的链霉亲和素试剂瓶、正常兔血清封闭液瓶，以及磷酸甘油缓冲液封片剂瓶；盒体内的纵向分隔板一侧形成卧置缓冲液瓶的空间，而分隔板另一侧形成存储分区载玻片的空间。载玻片上分别为肠道病毒71型病毒检测区和柯萨奇病毒A16病毒测试区。这样设计的本实用新型，能同时检测手足口病的两种常见病毒，具有简便、快速、易于判断的特点。
文档编号G01N33/569GK201828517SQ201020540029
公开日2011年5月11日 申请日期2010年9月25日 优先权日2010年9月25日
发明者傅金瑞, 李立和, 王高生 申请人:天津市宝坻区人民医院