专利名称：骨组织免疫组化抗原修复的方法以及相关的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物科学领域，具体涉及一种骨组织免疫组化抗原修复的方法以及相关的试剂盒。
背景技术：
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的技术，它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)中的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，因此在免疫组化染色后的镜下观察过程中，有可能出现下面一些问题阳性物反应不强，时隐时现，表达不均匀，有时可出现假阴性等。之所以会出现这些不利于观察的现象，原因主要有如下几个方面首先，组织在用甲醛固定的过程中所形成的醛键可封闭抗原的决定簇；其次，甲醛在保存进程中会形成羟甲基，也可封闭抗原决定族；在组织固定过程中，甲醛与蛋白质发生交联，形成醛交联蛋白，这种化合物封闭了抗原，使之无法表达出来。由于上面这些原因存在，因此极大地影响了免疫组化技术中对组织切片的观察，为了解决上述存在的问题，更好地暴露出抗原，将其很好地显示出来，目前世界上公认的方法就是必须进行抗原修复(Antigen retrieval) 0 Shi SR等在1991年发表的文章(参见Shi SR, Key ME, KalraKL. Antigen retrieval in formal in-fixed, paraffin-embeddedtissues an enhancement method forimmunohistochemical staining based onmicrowave oven heating of tissue sections.J Histochem Cytochem,1991,39(6)741-748)中首次提出抗原修复(Antigen retrieval)的概念。所谓抗原修复即利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程。至今为止，抗原修复有许多种方法，主要分为物理化学试剂抗原修复法及化学试剂抗原修复法这两种主要的修复方法。上述方法中，需要根据抗体种类不同，或者根据抗原的表达程度，或者根据组织不同来进行选择，不同的修复方法对于不同的组织也会产生不同的修复效果。骨组织不同于一般的软组织，其是一种坚硬的结缔组织，骨组织由粘多糖和一些胶原纤维样骨胶纤维构成的骨样组织和沉着于其中的无机盐(骨盐)形成的。无机盐以羟基磷灰石结晶的形式存在，其中绝大部分为水合磷酸钙，此外还包括微量碳酸盐和柠檬酸盐等。因此骨组织和其他一些已经钙化的组织在脱水、透明等制片过程前用单纯酸类、混合酸类、螯合剂、离子交换树脂和电解脱钙等方法，将组织中的钙盐用脱钙剂出去，才能够制成切片。骨组织的免疫组化是病理技术中的一大难题。由于骨组织中60%以上为钙盐组成的羟基磷灰石结晶，因而骨组织固定、脱钙都是制备标本的重要环节。一些强酸如盐酸、硝酸等虽能快速有效除去骨组织中的钙盐，但对其中的抗原蛋白也产生了致命性破坏。抗原的破坏会严重影响免疫组化的效果，因此除了需要在组织制片过程中将抗原最大程度地保护好以外，在骨组织免疫组化过程中，还必须进行有效的抗原修复。即在免疫组织化学前用物理或化学方法，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复。
然而，现有技术中，常规使用的骨组织抗原修复方法，如热抗原修复等物理法，容易造成骨组织掉片，掉片率甚至高于80%以上，并产生大量褶皱，影响抗原的观察；即使使用酶修复的方法，掉片率也高达70%以上，且产生大量褶皱，而且抗原暴露较差，显色很弱。即使在将载玻片换为硅化载玻片或氨基基片或后仍然存在上述现象。因此，本领域急需一种不容易造成脱片，且能够使得抗原暴露更充分的针对骨组织免疫组化的抗原修复方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的骨组织免疫组化中存在容易掉片以及骨组织抗原无法充分暴露等问题，提供一种用于骨组织免疫组化抗原修复的方法以及相关的试剂盒。本发明采用如下技术方案解决上述技术问题一种用于骨组织免疫组化抗原修复的方法，包括如下步骤取预热至18 37°C的透明质酸酶溶液加到骨组织切片样本上，覆盖整个骨组织切片样本，在18 37°C的温度条件下消化处理10 60分钟后清洗；然后取预热至18 37°C的胃蛋白酶溶液加到骨组织切片样本上，覆盖整个组织样本，在18 37°C的温度条件下消化处理20 60分钟后清洗，即可完成抗原修复。优选的,所述透明质酸酶溶液中,透明质酸酶的使用浓度为I. 5 2. 5mg/ml,工作pH值为4. 5 6. O。优选的，所述胃蛋白酶溶液中，胃蛋白酶的质量体积比浓度为O. 3 O. 5%，工作pH值为I. O 2. 5。这里所述的“质量体积比浓度”为溶质的质量与溶液体积的比例，表示每IOOml溶液中含有溶质的质量(单位以g计)，即1%= lg/100ml。优选的，所述透明质酸酶溶液消化处理的温度为23 28°C，所述胃蛋白酶溶液消化处理的温度为23 28°C。进一步优选的，针对每一片骨组织切片样本，每次使用的透明质酸酶溶液的体积为50 IOOul，每次使用的胃蛋白酶溶液的体积为50 IOOul。所述胃蛋白酶溶液和透明质酸酶溶液的溶剂可以使用本领域技术人员所公知的溶剂，如去离子水、生理盐水等。优选的，所述透明质酸酶的溶剂为灭菌后的去离子水，并使用HCl水溶液来调节至所需要的pH值，进一步优选使用O. lmol/L的HCl水溶液来调节PH值；所述胃蛋白酶溶液的溶剂为HCl水溶液，进一步优选为O. 08 O. 12mol/L的HCl水溶液，最优选为O. lmol/L的HCl水溶液。所述的胃蛋白酶及透明质酸酶均可由本领域技术人员通过市售途径获得。
本发明的第二方面，是提供了一种试剂盒，该试剂盒中包括透明质酸酶溶液和胃蛋白酶溶液，且所述透明质酸酶溶液的浓度为I. 5 2. 5mg/ml，所述胃蛋白酶溶液的质量体积比浓度为O. 3 0.5%。优选的,所述透明质酸酶溶液的pH值为4. 5 6. O,所述胃蛋白酶的pH值为I. O
2. 5o优选的，所述透明质酸酶的溶剂为灭菌后的去离子水，使用O. 08 O. 12mol/L的HCl溶液来调节至所需要的pH值；所述胃蛋白酶溶液的溶剂为HCl溶液，进一步优选为O. 08 O. 12mol/L的HCl溶液，最优选为O. lmol/L的HCl溶液。进一步优选的，所述试剂盒中，还含有磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为洗涤液，最优选的，所述洗涤液为含O. 05 %吐温-20的pH7. 4的磷酸盐缓冲液。本发明的第三方面，提供了上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤取预热至18 37°C的透明质酸酶溶液加到骨组织切片样本上，覆盖整个骨组织切片样本，在18 370C的温度条件下消化处理10 60分钟后清洗；然后取预热至18 37°C的胃蛋白酶溶液加到骨组织切片样本上，覆盖整个组织样本，在18 37°C的温度条件下消化处理20 60分钟后清洗，即可完成抗原修复。较佳的，所述透明质酸酶溶液消化处理后需用PBS洗涤液洗涤骨组织切片，且在胃蛋白酶溶液消化处理后需用PBS洗涤液洗涤骨组织切片。优选的，所述PBS洗涤的步骤为洗涤3次，每次洗涤2分钟。使用本发明的抗原修复试剂盒来针对骨组织切片进行抗原修复处理，能够克服传统抗原修复方法(物理法及单一化学法)具有的掉片率高、抗原暴露不充分的问题。传统的抗原修复方法处理后的骨组织切片一般掉片率高达90%，而采用本发明的抗原修复方法处理后的骨组织切片掉片率可以被极大程度地降低，解决了本领域技术人员长期以来难以解决的技术问题。同时，经本发明中所述的抗原修复方法处理后的骨组织切片与传统的抗原修复方法相比较，组织破损面积不超过该样品总面积的5%，且具有抗原暴露更加充分、显色效果好等特性。本发明中的试剂盒具有成本低、效果好等特点。
图1为实施例I中经过抗原修复处理后的骨组织切片染色结果示意图。图2为实施例2中经过抗原修复处理后的骨组织切片染色结果示意图。图3为实施例3中经过抗原修复处理后的骨组织切片染色结果示意图。图4为实施例4中经过抗原修复处理后的骨组织切片染色结果示意图。
图5为实施例I中的阴性对照组的染色结果示意图。
具体实施例方式下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 本发明实施例中使用的试剂名称及其购买途径如下表中所示。
权利要求
1.一种用于骨组织免疫组化抗原修复的方法，包括如下步骤 取预热至18 37°C的透明质酸酶溶液加到骨组织切片样本上，覆盖整个骨组织切片样本，在18 37°C的温度条件下消化处理10 60分钟后清洗；然后取预热至18 37°C的胃蛋白酶溶液加到骨组织切片样本上，覆盖整个组织样本，在18 37°C的温度条件下消化处理20 60分钟后清洗，即可完成抗原修复。
2.如权利要求I中所述的用于骨组织免疫组化抗原修复的方法，其特征在于，所述透明质酸酶溶液中，透明质酸酶的浓度为I. 5 2. 5mg/ml,pH值为4. 5 6. 0 ;所述胃蛋白酶溶液中，胃蛋白酶的质量体积比浓度为0. 3 0. 5%，pH值为I. 0 2. 5。
3.如权利要求I中所述的用于骨组织免疫组化抗原修复的方法，其特征在于，所述透明质酸酶消化处理的温度为23 28°C，所述胃蛋白酶消化处理的温度为23 28°C。
4.如权利要求I中所述的用于骨组织免疫组化抗原修复的方法，其特征在于，所述透明质酸酶溶液的溶剂为去离子水；所述胃蛋白酶溶液的溶剂为HCl水溶液。
5.如权利要求I 4中任一所述的用于骨组织免疫组化抗原修复的方法，其特征在于，针对每一片骨组织切片样本，每次使用的透明质酸酶溶液的体积为50 lOOul，每次使用的胃蛋白酶溶液的体积为50 lOOul。
6.一种用于骨组织免疫组化抗原修复的试剂盒，该试剂盒中包括透明质酸酶溶液和胃蛋白酶溶液，且所述透明质酸酶溶液中，透明质酸酶的浓度为I. 5 2. 5mg/ml, pH值为4.5 6. 0 ;所述胃蛋白酶溶液中，胃蛋白酶的质量体积比浓度为0. 3 0. 5 %，pH值为I.0 2. 5。
7.如权利要求6中所述的用于骨组织免疫组化抗原修复的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有PBS洗涤液。
8.如权利要求6中所述的用于骨组织免疫组化抗原修复的试剂盒，其特征在于，所述透明质酸酶溶液的溶剂为去离子水；所述胃蛋白酶溶液的溶剂为HCl水溶液。
9.权利要求6-8中任一所述的用于骨组织免疫组化抗原修复的试剂盒的使用方法，包括如下步骤取预热至18 37°C的透明质酸酶溶液加到骨组织切片样本上，覆盖整个骨组织切片样本，在18 37°C的温度条件下消化处理10 60分钟后清洗；然后取预热至18 37°C的胃蛋白酶溶液加到骨组织切片样本上，覆盖整个组织样本，在18 37°C的温度条件下消化处理20 60分钟后清洗，即可完成抗原修复。
10.如权利要求9中所述的用于骨组织免疫组化抗原修复的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述透明质酸酶溶液消化处理后需用PBS洗涤液洗涤骨组织切片样本，且在胃蛋白酶溶液消化处理后需用PBS洗涤液洗涤骨组织切片样本。
11.权利要求6-8中任一所述的用于骨组织免疫组化抗原修复的试剂盒在骨组织免疫组化领域的应用。
全文摘要
本发明属于生物科学领域，具体涉及一种骨组织免疫组化抗原修复的方法以及相关的试剂盒。所述方法包括如下步骤取透明质酸酶溶液加到骨组织切片样本上，消化处理后清洗；然后取胃蛋白酶溶液加到骨组织切片样本上，消化处理20～60分钟后清洗。本发明还公开了一种骨组织免疫组化抗原修复试剂盒及其制备方法与应用。本发明的抗原修复方法能够将骨组织免疫组化样本在抗原修复后的掉片率降低至5%以下，组织破损面积不超过该样品总面积的5%，样品抗原暴露效果更好。本发明的抗原修复方法及相关试剂盒解决了骨组织免疫组化的严重掉片和抗原暴露不充分的问题，可以广泛适应各种骨组织的免疫组化实验。
文档编号G01N33/53GK102620979SQ20111003425
公开日2012年8月1日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者田鸣, 陈海清 申请人:上海舜百生物科技有限公司