专利名称：半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以半胱天冬酶-3酶原(Procaspase-3)单克隆抗体、生物素化二抗、显色液以及对照片为主要成分的SP法免疫组化试剂盒及应用。
背景技术：
Procaspase-3是Caspase-3的前体酶原，在凋亡信号的传递过程中起着至关重要的作用。I^ocaspase-3不但接收外源性凋亡通路级联刺激，而且也被内源性凋亡通路所激活。Procaspase-3是整个凋亡通路的最下游分子，所以一旦它发生表达异常或功能变化，整个凋亡信号通路就会被阻断或激活。目前，已有越来越多的文献报道细胞凋亡与许多疾病密切相关。现已证实神经退行性疾病的发病原因之一就是大脑内的某些核团的神经元发生凋亡，从而导致记忆减退和行为异常。此外，也有研究证实慢性肝炎和慢性肾炎患者的肝脏或肾脏组织中 Procaspase-3表达增高，且其表达水平与病程进展密切相关，这说明ftOcaspase-3也是慢性肝炎和肾炎的生物学标志物。此外，癌症的发病原因也与凋亡密切相关。有研究表明，在结肠癌组织中ft~0CaSpase-3表达水平高于周围正常组织的六倍。此外，在神经母细胞瘤、 淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、肝癌等恶性肿瘤也发现了 ft~0CaSpase-3过度表达的现象，并发现其表达水平与某些恶性肿瘤患者的预后密切相关，这说明ft~0CaSpase-3也可以作为某些恶性肿瘤的生物学标志物和预后标志物。无论是神经退行性疾病、慢性肝炎和肾炎、还是恶性肿瘤都依然是临床上难以攻克的疾病，早诊断早治疗是这些疾病唯一的希望。本试剂盒可检测凋亡执行蛋白Procaspase-3，这会有助于这些疾病的早期诊断。除了作为上述疾病的诊断生物学标志物外，Procaspase-3也是肿瘤靶向治疗的理想靶点之一。最近，Putt等人报道他们发现一种Procaspase-3激活剂，即PAC-I, 可以使ftOcaspase-3酶原转化成有活性的Caspase-3，且能迅速导致肿瘤细胞凋亡。荷瘤裸鼠和犬模型实验也证明PAC-I靶向性和高效性，显示了巨大的市场开发潜力。由于 Procaspase-3激活剂药物的适应症为ftOcaspase-3阳性的恶性肿瘤患者，因此在进行临床研究乃至今后临床应用时，需要确定备选患者肿瘤组织ft~0CaSpase-3抗原的表达情况。 但是，目前在国内外市场上还未见ftx)CaSpase-3蛋白诊断试剂盒。因此，医学上迫切需要开发一种能够快速、便捷且准确地进行ft~0CaSpase-3蛋白表达检测的体外诊断用品。由于目前国内外还未见ftOcaspase-3蛋白免疫组化诊断试剂盒，己有的检测组织中I^ocaspase-3蛋白方法操作程序烦琐，非特异性高，不能迅速、准确的判断患者肿瘤组织ftOcaspase-3抗原的表达情况。
发明内容
本发明的目的是提供一种ft~0CaSpaSe-3蛋白免疫组织化学诊断试剂盒。本发明的另一目的是提供一种能够准确测定受试者组织中的ft~0CaSpaSe-3抗原的表达情况的对照片。
本发明的第三个目的是提供一种检测受试者肿瘤组织中I^ocaspase-3抗原表达水平的方法。在本发明的第一方面，提供了一种I^rocaspase-3蛋白免疫组化诊断试剂盒。作为本发明的一个优选例，在所述的ftOcaspase-3蛋白免疫组化诊断试剂盒中， 所述试剂盒中包含免疫组化染色试剂，所述免疫组化染色试剂包含与组织抗原连接的初始抗体、与初始抗体连接的第二抗体、酶、底物、显色剂、非特异性结合位点的阻断剂及缓冲液。作为本发明的一个优选例，在ft~0CaSpaSe-3蛋白免疫组化诊断试剂盒中，所述的初始抗体为抗ftOcaspase-3人源化单克隆抗体、鼠源抗ftOcaspase-3单克隆抗体、兔源抗 Procaspase-3单克隆抗体，或上述初始抗体工作液；所述的第二抗体为生物素标记的抗人 IgG、抗鼠IgG或抗兔IgG，或上述第二抗体工作液；所述的非特异性结合位点的阻断剂可选自动物血清或白蛋白；所述的酶为辣根过氧化物酶；所述的底物为H2A ；或所述的显色剂选自=DAB-H2A ；所述的缓冲液为20倍磷酸盐缓冲液。在本发明的第二方面，提供了一种检测组织中I^ocaspase-3蛋白表达的对照片， 所述的对照片的一个主表面上具有以下区域
(1)Procaspase-3高表达对照区，所述的高表达对照区设有ftOcaspase-3高表达的肿瘤组织切片；
(2)Procaspase-3中表达对照区，所述的中表达对照区设有ftOcaspasel中表达的肿瘤组织切片；
(3)Procaspase-3无表达对照区，所述的无表达对照区设有ftOcaspase-3无表达的组织切片；(4) Procaspase-3检测区，所述的检测区用于放置待检测的组织样本。本发明的一个优选例，在所述的检测组织中ftOcaspase-3表达的对照片中， 所述ftOcaspase-3高表达的肿瘤组织切片选自HL60或H印-G2肿瘤组织切片； 所述ftOcaspase-3中表达的肿瘤组织切片选自DU145或U87肿瘤组织切片；所述 Procaspase-3无表达的肿瘤组织切片选自MCF_7肿瘤组织切片。作为本发明的一个优选例，在所述的检测组织中I^ocaspase-3表达的测试片中， 所述的组织切片为石蜡包埋的切片或冰冻组织切片。在本发明的第三方面，提供了一种体外检测样品中ft~0CaSpase-3抗原表达水平的检测和评定方法，所述的样品是肿瘤组织、肝组织、肾组织或脑组织，该方法包括步骤
(1)将组织制成切片；
(2)将所述切片置于所述对照片中的I^ocaspase-3检测区，按照实验实施例5的方法进行免疫组化染色检测；
(3)将样品的染色情况与对照片上ft~0Caspase-3高表达、中表达、无表达的组织切片的染色情况进行比较，结果判定如下
染色情况彡ftx)CaSpase-3高表达区，判为强阳性(+ + + )； 染色情况介于ftOcaspase-3中表达区和ftOcaspase-3高表达区之间，判为中强阳性(++)；
染色情况介于ftOcaspase-3低表达区和ftOcaspase-3中表达区之间，判为弱阳性
(+)；染色情况彡Procaspase-3低表达区，判为阴性(_)。本发明中I^ocaspase-3蛋白方法操作程序简单，特异性高，能迅速、准确的判断患者肿瘤组织ftOcaspase-3抗原的表达情况。
图1显示了几种细胞呈现不同表达水平检测结果，从左向右分别表示HL60细胞的结果，其ftOcaspasej高表达；MCF-7细胞的结果，其ftOcaspase-3无表达；H印G2细胞的结果，其ftOcaspasej高表达；DU145细胞的结果，其ftOcaspase-3中度表达；A549细胞的结果，其ftx)caspase-3中高度表达；U87细胞的结果，其ftx)caspase-3中度表达。图2显示了强阳、阳和弱阳性的切片组织的一些照片，各样品均为细胞浆定位表达，其中，A 为(+) ；B 为(++) ；C 为(+++)。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，未详细说明的技术为常规技术。实验实施例1 ft~0CaSpaSe-3蛋白免疫组化诊断试剂盒组成表1 40人份/盒产品组成及主要成分
权利要求
1.半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒是采用免疫组化方法，其中包含免疫组化染色剂。
2.根据权利要求1所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于， 所述免疫组化染色剂包含与组织抗原连接的初始抗体、与初始抗体连接的第二抗体、酶、 底物、显色剂、非特异性结合位点的阻断剂及缓冲液。
3.根据权利要求2所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于， 所述的初始抗体为抗半胱天冬酶-3酶原人源化单克隆抗体或鼠源抗半胱天冬酶-3酶原单克隆抗体，或上述初始抗体工作液；所述的第二抗体为生物素标记的抗人IgG或抗鼠IgG， 或上述第二抗体工作液；所述的非特异性结合位点的阻断剂可选自动物血清，白蛋白；所述的酶为辣根过氧化物酶所述的底物为H2A ；所述的显色剂选自=DAB-H2A或AEC-H2A ； 所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒包含阳性对照片。
5.根据权利要求4所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于， 所述的对照片的一个主表面上具有以下区域(1)半胱天冬酶-3酶原高表达对照区，所述的高表达对照区设有半胱天冬酶-3酶原高表达的肿瘤组织切片；(2)半胱天冬酶-3酶原中表达对照区，所述的中表达对照区设有半胱天冬酶-3酶原中度表达的肿瘤组织切片；(3 )半胱天冬酶-3酶原无表达对照区，所述的无表达对照区设有半胱天冬酶-3酶原无表达的肿瘤组织切片；(4)半胱天冬酶-3酶原检测区，所述的检测区用于放置待检的组织。
6.根据权利要求5所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于， 所述半胱天冬酶-3酶原高表达的肿瘤组织切片选自HL60或Hep-G2肿瘤组织切片；所述半胱天冬酶-3酶原中表达的肿瘤组织切片选自DU145或U87肿瘤组织切片；所述半胱天冬酶-3酶原无表达的肿瘤组织切片选自MCF-7肿瘤组织切片。
7.根据权利要求5-6中任一所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，检测组织中半胱天冬酶-3酶原表达的对照片中所述的组织切片为石蜡包埋的切片或冰冻组织切片。
8.权利要求1-7中任何一项所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒在药物靶标检测，体外检测组织中半胱天冬酶-3酶原抗原表达水平的评定及恶性肿瘤进展程度、神经退行性病变、肝脏纤维化和肾损伤程度的诊断方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，体外检测组织中半胱天冬酶-3酶原抗原表达水平的评定的步骤如下(1)组织切片样本染色a对于石蜡包埋组织标本可进行系列脱水脱蜡及抗原修复；对于冰冻组织切片需进行系列脱水；b 3%过氧化氢孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，3分钟X3次；c滴加封闭用正常牛血清工作液，37度孵育40分钟，倾去，误洗；d滴加一抗(抗体稀释液稀释200倍)，每片50uL，37°C孵育池；PBS冲洗，3分钟X 3次， e滴加二抗工作液，每片50uL，37°C孵育Ih ；PBS冲洗，3分钟X3次， f 滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液，每片50uL，37°C孵育20min ；PBS冲洗，3分钟X3次；g DAB显色室温，ImlPBS中加色原底物溶液和色原底物缓冲液各1滴，混勻后滴于切片上，每片120ul，作用2min ；h终止反应，用PBS洗去DAB ； i镜检，拍照；(2)将样品的染色情况与对照片上半胱天冬酶-3酶原高表达、中表达、无表达的组织切片的染色情况进行比对，结果判定如下A.染色情况>半胱天冬酶-3酶原高表达区，判为强阳性(+++)；B.染色情况介于半胱天冬酶-3酶原中表达区和半胱天冬酶-3酶原高表达区之间，判为中强阳性阴性(++);C.染色情况介于半胱天冬酶-3酶原无表达区和半胱天冬酶-3酶原中表达区之间，判为弱阴性(+ );D.染色情况<半胱天冬酶-3酶原无表达区，判为阴性(-)。
全文摘要
本发明公开了一种半胱天冬酶-3酶原(Procaspase-3)免疫组化诊断试剂盒及其检测方法。该试剂盒含有免疫组化染色剂，包含与组织抗原连接的初始抗体、与初始抗体连接的第二抗体、酶、底物、显色剂、非特异性结合位点的阻断剂及缓冲液，它能够准确测定受试者组织中Procaspase-3抗原的表达水平和细胞定位情况，为以Procaspase-3蛋白为靶点的药物在临床上的应用提供指导，并为临床诊断恶性肿瘤、肝纤维化、肾损伤及神经退行性病变提供参考。本发明还公开了一种检测Procaspase-3蛋白表达水平的对照片，所述的对照片上具有Procaspase-3高表达对照区、Procaspase-3中表达对照区、Procaspase-3无表达(或低表达)对照区以及用于放置待检测组织的Procaspase-3检测区。本对照片为评定Procaspase-3的表达水平提供了准确的评价标准。
文档编号G01N33/577GK102183651SQ20111004234
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月22日 优先权日2011年2月22日
发明者吴春福, 宫平, 杨静玉, 王立辉 申请人:沈阳药科大学