专利名称：一种用于检测镍离子的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测待测样品中镍离子的存在或浓度的化合物、含有该化合物的试剂、使用该化合物检测待测样品中镍离子的存在或浓度的方法，以及该化合物在制备用于检测待测样品中镍离子的存在或浓度的试剂的用途。
背景技术：
重金属及其离子的污染向来是一个很严重的环境问题。以重金属离子为代表的无机污染物一旦进入环境后，不会像有机污染物那样在环境中被快速分解，它们可能长期残留于环境中，产生经久不衰的污染。而进入人体的重金属离子对人体的健康也存在着巨大危害，如一些重金属离子对人的神经系统、造血系统、呼吸系统和肾脏等具有严重的破坏能力，还有一些离子具有致癌作用。镍离子进入人体后，能产生皮炎、头疼、呕吐、肺出血及虚脱症状，过量积累会影响呼吸系统和免疫系统，最大的危害是引起肺癌和鼻癌。因此，对环境中的镍离子进行检测显得尤为重要。测定痕量重金属离子的检测方法一般包括原子吸收光谱和等离子体发射光谱 (ICP)、电化学方法、比色法以及荧光探针等手段。其中，原子吸收光谱和ICP方法具有选择性好、灵敏度高和测量范围广等优点，但是它们对仪器要求高，操作复杂，分析成本较昂贵， 难以大规模应用；电化学方法包括阳极溶出法和离子选择性电极等方法，它的特点在于灵敏度很高，而选择性稍差一些；比色法是以朗伯-比尔定律(亦称光的吸收定律)为基础， 其优点是准确、灵敏、快速、简便而费用又低，但污染物必须先与显色试剂作用转化成有色化合物后才能被测定；荧光探针技术应用于过渡金属及其重金属离子的检测，不但方便、快捷，通常还具有较高的灵敏度和选择性，荧光测量方法是非侵入性的，对样品不具破坏性， 是其它分析方法如原子吸收光谱、离子选择性电极分析等无法比拟的，但荧光探针通常在有机溶剂中有较好的检测效果，而在水溶液中有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够检测待测样品中镍离子的存在或浓度的化合物，当有镍离子存在时，该化合物的荧光显著增强，因此，可作为检测镍离子的存在或浓度的荧光探针。本发明的化合物不仅能够在有机溶剂中而且能够在水溶液中检测镍离子的存在或浓度，使用时操作简便、快速，且成本低，具有灵敏度高、选择性好的优点。本发明用于检测待测样品中镍离子的存在或浓度的化合物具有下述通式I的结构
F-Gly-Ala-Xaa-Arg-His-Trp-Ly S-Phe-LpS-NH2
Q(I) 其中，Xaa为Ser或Ilir ；F连接在Gly的氮上，Q连接在Lys的ε氮上；F为荧光基团，且Q为淬灭基团；或者F为淬灭基团，且Q为荧光基团；并且F与Q相互配对，从而使H3COv
MOCAc通式I化合物可以通过本领域公知的固相多肽合成法制备得到。例如，米用FMOC固相多肽合成法，以F为荧光基团7-甲氧基香豆素-4-乙酰基(MOCAc-)， 且Q为淬灭基团2，4- 二硝基苯基(Dnp-)为例，选用Rink amide-AM Resin树脂， 分别以 Fmoc-Lys(Dnp)-OH, Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Xaa 为 Ser 时选用 Fmoc-Ser (tBu) -OH 或者 Xaa 为 Thr 时选用 Rnoc-Thr (tBu)-0H，Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, 7-甲氧基香豆素-4-乙酸 (MOCAc)为单体，以苯并三氮唑-N，N, N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)为缩合剂， 含20%哌啶的N' , N' - 二甲基甲酰胺(DMF)溶液为脱保护试剂，依次进行缩合得到多肽树脂；将多肽树脂用切割试剂——三氟乙酸(TFA)纯水苯甲硫醚苯酚乙二硫醇= 82.5 5 5 5 2.5(体积比)溶液进行切割，使之与树脂分离，过滤后在冰乙醚中析出多肽，冷冻干燥后得多肽粗品。可通过HPLC采用C18反相柱对多肽粗品进行纯化，以含 0. 1% TFA的乙腈/水为流动相进行梯度洗脱，最后采用ESI-MS鉴定所得产品。通式I化合物在镍离子存在时，多肽链发生断裂，荧光基团失去淬灭基团对其的淬灭作用后，释放出强的荧光，因此可以用于镍离子的定性检测。通式I化合物在镍离子存在时释放出的荧光强度与镍离子的浓度成正比。本领域技术人员可以理解，通过测定在不同浓度的镍离子存在时通式I化合物的荧光强度，可以制作以镍离子浓度为横坐标、以荧光强度为纵坐标的标准曲线，或者制作以荧光强度为横
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得在所述化合物的多肽链断裂前所述荧光基团基本上被所述淬灭基团淬灭，而在镍离子的作用下，所述化合物的多肽链发生断裂，继而荧光基团释放出强的荧光，其荧光强度与镍离子的浓度呈线性关系，因此该化合物可用于检测待测样品中镍离子的存在或浓度。本领域技术人员可以理解，各种相互配对的荧光基团和淬灭基团均可用于本发明。例如，荧光基团为荧光素-6-酰基(6-FAM-)，淬灭基团为4- ' 二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酰基(DABCYL-)；或者荧光基团为四甲基罗丹明-6-酰基(TMR-)，淬灭基团为4-(4' 二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酰基；或者荧光基团为7-甲氧基香豆素-4-乙酰基((7-Methoxycoumarin-4-yl) acetyl-，简称 MOCAc-)，淬灭基团为 2，4_ 二硝基苯基(2， 4-Dinitrophenyl-,简称Dnp-)。优选荧光基团为7-甲氧基香豆素_4_乙酰基，淬灭基团为 2,4- 二硝基苯基。最优选F为7-甲氧基香豆素-4-乙酰基，Q为2，4- 二硝基苯基。优选的通式I 化合物为 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -N
H2，其结构如下坐标、以镍离子浓度为纵坐标的标准曲线，然后测定相同条件下待测样品的荧光强度，根据标准曲线可以获知镍离子浓度，从而实现对镍离子的定量检测。本领域技术人员可以理解，可以将通式I化合物与合适的辅料制成用于检测待测样品中镍离子的存在或浓度的试剂，当然通式I化合物与合适的辅料也可以分开包装，于临用前混合。合适的辅料例如包括使用通式I化合物检测待测样品时所需的溶剂等。因此，本发明还提供了使用通式I化合物或者含有通式I化合物的试剂检测待测样品中镍离子的存在或浓度的方法，包括如下步骤i.在溶液中将待测样品与通式I化合物反应的步骤；ii.检测溶液荧光强度的步骤。用于本发明的溶液的溶剂可以选自水、乙腈、甲醇、乙醇及其组合，优选用于本发明的溶液为I-IOOmM的Tris水溶液，最优选20mM的Tris水溶液。检测时通式I化合物在溶液中的浓度为0. 1-10 μ Μ，优选0. 5-8 μ Μ,最优选5 μ M ；反应的温度为25-85°C，优选 40-80°C，最优选75°C ；反应的时间为5分钟至2小时，优选10-40分钟，最优选30分钟。本发明还提供了通式I化合物在制备用于检测待测样品中镍离子的存在或浓度的试剂的用途。本发明的优点在于通式I化合物不仅能够在有机溶剂中而且能够在水溶液中检测镍离子的存在或浓度，使用时操作简便、快速，并且灵敏度高、选择性好。使用本发明的通式I化合物可以对包括但不限于饮用水、食品、工业废水、河流、土壤等进行镍离子的定性或定量检测。
图 1 为化合物 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -NH2 的 HPLC 图谱。图 2 为化合物 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -NH2 的质谱图。图 3 为化合物 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -NH2 对镍离子进行定性检测的荧光图。图 4 为化合物 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -NH2 对镍离子进行定量检测的荧光图。图 5 为化合物 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -NH2 检测不同浓度的镍离子后荧光强度和镍离子初始浓度的线性关系图。图 6 显示化合物 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -NH2 对镍离子的选择性。图 1 为化合物 MOCAc-Gly-Ala-Thr-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -NH2 对镍离子进行定性检测的荧光图。
具体实施例方式实施例1 :MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp)-NH2 的合成按照FMOC 化学标准方法合成。取 400mg(0. 5mmol/g)的 Rink amide-AM Resin (吉尔生化(上海)有限公司)树脂置于固相反应器中，加5ml 二氯甲烷溶胀过夜，减压抽去溶剂，再用含20 %哌啶的DMF溶液5ml脱除树脂上的Fmoc基团。将0. 8mmol的Fmoc 保护的氨基酸、0. 8mmol的1_羟基苯并三氮唑(HOBt)、0. 78mmol的HBTU溶于的 DMF中形成反应液。将反应液倒入固相反应器中，活化5分钟，加入l.emmol N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，室温摇荡2小时进行多肽耦合；用5ml DMF清洗树脂5次，再用含有 20%哌啶的DMF溶液5ml脱除氨基酸上的Fmoc基团，用5ml DMF清洗树脂5次。如此循环，分别以 Fmoc-Lys (Dnp) -OH, Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu) -OH, Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH 为单体按顺序合成多肽，然后将Immol的7-甲氧基香豆素-4-乙酸，Immol的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、0. 97mmol的HBTU溶于細1的DMF中形成反应液，将反应液倒入固相反应器中，活化5分钟，加入2mmol N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，室温摇荡2小时，使7-甲氧基香豆素-4-乙酸与多肽的氨基末端进行耦合反应接上荧光基团，最后用5ml DMF清洗树脂5次， 5ml 二氯甲烷清洗树脂5次，真空干燥，得到多肽树脂。 将真空干燥的多肽树脂放入圆底烧瓶，在冰水浴条件下缓慢加入切割试剂——三氟乙酸纯水苯甲硫醚苯酚乙二硫醇=82. 5:5:5:5: 2. 5(体积比)溶液鈿1， 磁力搅拌池进行切割反应，使多肽与树脂分离，经砂芯过滤后，用氮气吹干后加入20ml冰乙醚析出多肽，经冷冻干燥得多肽粗品，通过HPLC采用C18半制备反相柱对多肽粗品进行纯化，以含0. TFA的乙腈/水为流动相进行10-50%乙腈梯度洗脱，纯化后多肽通过分析型HPLC纯度鉴定(图1)，并采用ESI-MS对产品进行鉴定(图2)，该化合物(M+2H)2+ = 749. 65，该化合物的理论分子量为1497. 631。实施例 2 :MOCAc-Gly-Ala-Thr-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -NH2 的合成按照FMOC 化学标准方法合成。取 400mg(0. 5mmol/g)的 Rink amide-AM Resin (吉尔生化(上海)有限公司)树脂置于固相反应器中，加5ml 二氯甲烷溶胀过夜，减压抽去溶剂，再用含20 %哌啶的DMF溶液5ml脱除树脂上的Fmoc基团。将0. 8mmol的Fmoc 保护的氨基酸、0. 8mmol的1_羟基苯并三氮唑(HOBt)、0. 78mmol的HBTU溶于的 DMF中形成反应液。将反应液倒入固相反应器中，活化5分钟，加入l.emmol N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，室温摇荡2小时进行多肽耦合；用5ml DMF清洗树脂5次，再用含有 20%哌啶的DMF溶液5ml脱除氨基酸上的Fmoc基团，用5ml DMF清洗树脂5次。如此循环，分别以 Fmoc-Lys (Dnp) -OH, Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH 为单体按顺序合成多肽，然后将Immol的7-甲氧基香豆素-4-乙酸，Immol的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、0. 97mmol的HBTU溶于細1的DMF中形成反应液，将反应液倒入固相反应器中，活化5分钟，加入2mmol N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，室温摇荡2小时，使7-甲氧基香豆素-4-乙酸与多肽的氨基末端进行耦合反应接上荧光基团，最后用5ml DMF清洗树脂5次， 5ml 二氯甲烷清洗树脂5次，真空干燥，得到多肽树脂。将真空干燥的多肽树脂放入圆底烧瓶，在冰水浴条件下缓慢加入切割试剂——三氟乙酸纯水苯甲硫醚苯酚乙二硫醇=82. 5:5:5:5: 2. 5(体积比)溶液鈿1， 磁力搅拌池进行切割反应，使多肽与树脂分离，经砂芯过滤后，用氮气吹干后加入20ml冰乙醚析出多肽，经冷冻干燥得多肽粗品，通过HPLC采用C18半制备反相柱对多肽粗品进行纯化，以含0. 1 % TFA的乙腈/水为流动相进行10-50%乙腈梯度洗脱，并采用ESI-MS对产品进行鉴定，该化合物(M+2H)2+ = 756. 87，该化合物的理论分子量1511. 631。实施例3 =TMR-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (DABCYL) -NH2 的合成按照FMOC 化学标准方法合成。取 400mg(0. 5mmol/g)的 Rink amide-AM Resin (吉尔生化(上海)有限公司)树脂置于固相反应器中，加5ml 二氯甲烷溶胀过夜，减压抽去溶齐U，再用含20%哌啶的DMF溶液5ml脱除树脂上的Fmoc基团。将0. 8mmol的Fmoc保护的氨基酸、0. aiimol的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、0. 78mmol的HBTU溶于4ml的DMF 中形成反应液。将反应液倒入固相反应器中，活化5分钟，加入l.emmol N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，室温摇荡2小时进行多肽耦合；用5ml DMF清洗树脂5次，再用含有20 % 哌啶的DMF溶液5ml脱除氨基酸上的Fmoc基团，用5ml DMF清洗树脂5次。如此循环， 分另Ij 以 Fmoc-Lys (DABCYL) -OH, Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH, Fmoc-His(Trt) -OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu) -OH, Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH 为单体按顺序合成多肽，然后将Immol的6-羧酸四甲基罗丹明，Immol的1_羟基苯并三氮唑 (HOBt)、0. 97mmol的HBTU溶于細1的DMF中形成反应液，将反应液倒入固相反应器中，活化 5分钟，加入2mmol N, N-二异丙基乙胺(DIEA)，室温摇荡2小时，使6-羧酸四甲基罗丹明与多肽的氨基末端进行耦合反应接上荧光基团，最后用5ml DMF清洗树脂5次，5ml 二氯甲烷清洗树脂5次，真空干燥，得到多肽树脂。将真空干燥的多肽树脂放入圆底烧瓶，在冰水浴条件下缓慢加入切割试剂——三氟乙酸纯水苯甲硫醚苯酚乙二硫醇=82. 5:5:5:5: 2. 5(体积比)溶液鈿1， 磁力搅拌池进行切割反应，使多肽与树脂分离，经砂芯过滤后，用氮气吹干后加入20ml冰乙醚析出多肽，经冷冻干燥得多肽粗品，通过HPLC采用C18半制备反相柱对多肽粗品进行纯化，以含0. 1 % TFA的乙腈/水为流动相进行10-50%乙腈梯度洗脱，并采用ESI-MS对产品进行鉴定，该化合物(M+2H)2+ = 890. 45，该化合物的理论分子量1779. 078。实施例4 :6-FAM-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (DABCYL) -NH2 的合成按照FMOC 化学标准方法合成。取 400mg(0. 5mmol/g)的 Rink amide-AM Resin (吉尔生化(上海)有限公司)树脂置于固相反应器中，加5ml 二氯甲烷溶胀过夜，减压抽去溶齐U，再用含20%哌啶的DMF溶液5ml脱除树脂上的Fmoc基团。将0. 8mmol的Fmoc保护的氨基酸、0. aiimol的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、0. 78mmol的HBTU溶于4ml的DMF 中形成反应液。将反应液倒入固相反应器中，活化5分钟，加入l.emmol N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，室温摇荡2小时进行多肽耦合；用5mlDMF清洗树脂5次，再用含有20% 哌啶的DMF溶液5ml脱除氨基酸上的Fmoc基团，用5ml DMF清洗树脂5次。如此循环， 分另Ij 以 Fmoc-Lys (DABCYL) -OH, Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu) -OH, Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH 为单体按顺序合成多肽，然后将Immol的6-羧酸荧光素，Immol的1_羟基苯并三氮唑(HOBt)、 0. 97mmol的HBTU溶于細1的DMF中形成反应液，将反应液倒入固相反应器中，活化5分钟， 加入2mmol N, N- 二异丙基乙胺(DIEA)，室温摇荡2小时，使6-羧酸荧光素与多肽的氨基末端进行耦合反应接上荧光基团，最后用5ml DMF清洗树脂5次，5ml 二氯甲烷清洗树脂5 次，真空干燥，得到多肽树脂。将真空干燥的多肽树脂放入圆底烧瓶，在冰水浴条件下缓慢加入切割试剂——三氟乙酸纯水苯甲硫醚苯酚乙二硫醇=82. 5:5:5:5: 2. 5(体积比)溶液鈿1， 磁力搅拌池进行切割反应，使多肽与树脂分离，经砂芯过滤后，用氮气吹干后加入20ml冰乙醚析出多肽，经冷冻干燥得多肽粗品，通过HPLC采用C18半制备反相柱对多肽粗品进行纯化，以含0. 1 % TFA的乙腈/水为流动相进行10-50%乙腈梯度洗脱，并采用ESI-MS对产品进行鉴定，该化合物(M+2H)2+ = 863. 53，该化合物的理论分子量1724. 948。实施例5 使用 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -NH2 进行定性检测将实施例1 制备得到的化合物 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (D np) -NH2用超纯水溶解，并稀释至7. 14 μ M得溶液Α。将溶液A、Tris溶液(IOOmM Tris, ρΗ =10)和参比溶液或待测样品溶液按体积比7 2 1的比例加入离心管混合均勻得溶液 B。将溶液B放入75°C水浴锅内孵育30分钟，然后用荧光分光光度计检测溶液B在激发波长为328nm，发射波长从340nm到500nm处的荧光强度。参比溶液为不含镍离子的超纯水溶液，待测样品溶液为含有镍离子的氯化镍超纯水溶液。当待测样品溶液在390nm处的荧光强度强于参比溶液的荧光强度时，说明待测样品中含有镍离子。图3中，a曲线为不含镍离子的超纯水溶液的荧光强度曲线，b曲线为待测样品溶液含有0. 8 μ M镍离子的氯化镍超纯水溶液的荧光强度曲线。实施例6 使用 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -NH2 进行定量检测将实施例1 制备得到的化合物 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (D np) -NH2用超纯水溶解，并稀释至7. 14 μ M得溶液Α。将溶液A、Tris溶液(IOOmM Tris, ρΗ =10)和不含镍离子的超纯水溶液(参比溶液)或者含不同浓度(分别为0. 1μΜ，0.2μΜ， 0. 4 μ Μ，0. 6 μ Μ，0. 8 μ Μ，1 μ Μ，1. 2 μ Μ，1. 4 μ Μ，1. 6 μ Μ)镍离子的氯化镍超纯水溶液(待测样品溶液)，按照体积比7 2 1的比例加入离心管混合均勻得溶液B，将溶液B放入75°C 水浴锅内孵育30分钟，然后用荧光分光光度计检测溶液B在激发波长为328nm，发射波长从 340nm到500nm处的荧光强度。图4中，a曲线为不含镍离子的超纯水溶液的荧光强度曲线， b、c、d、e、f、g、h、i、j 曲线分别为镍离子浓度为 0. 1 μ Μ, 0. 2 μ Μ, 0. 4 μ Μ, 0. 6 μ Μ, 0. 8 μ Μ, 1 μ Μ，1. 2 μ Μ，1. 4 μ Μ，1. 6 μ M的氯化镍超纯水溶液的荧光强度曲线。图5为以待测样品溶液中的镍离子浓度为横坐标，以390nm处的荧光强度为纵坐标制作的标准曲线。实施例7 其他金属离子的存在对于镍离子检测的干扰将实施例1 制备得到的化合物 MOCAc-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (D np) -NH2用超纯水溶解，并稀释至7. 14 μ M得溶液Α。将溶液A、Tris溶液(IOOmM Tris, ρΗ =10)和待测样品按体积比7 2 1的比例加入离心管混合均勻得溶液B。首先用荧光分光光度计检测溶液B在激发波长为328nm，发射波长为390nm处的荧光强度Ftl，然后将溶液B放入75 °C水浴锅内孵育30分钟，再用荧光分光光度计检测溶液B在激发波长为328nm， 发射波长390nm处的荧光强度F。其中，待测样品分别为不含镍离子的超纯水溶液、含ΙΟμΜ镍离子的氯化镍超纯水溶液、含100 μ M 二价钡离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价钡离子和10 μ M镍离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价铅离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价铅离子和10 μ M镍离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价镁离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价镁离子和10 μ M镍离子的超纯7/7页
水溶液、含100 μ M 二价钴离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价钴离子和10 μ M镍离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价钙离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价钙离子和10 μ M镍离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价铜离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价铜离子和10 μ M镍离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价铁离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价铁离子和10 μ M镍离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价锌离子的超纯水溶液、含100 μ M 二价锌离子和10 μ M镍离子的超纯水溶液。依次以上述待测样品测得的F/^为纵坐标得到图6中的柱形图，其中白色柱形图为不含镍离子的相应溶液，黑色柱形图为含镍离子的相应溶液。该实施例的结果表明本发明化合物对于镍离子的选择性高，常见的金属离子对检测镍离子没有影响。实施例8 使用 MOCAc-Gly-Ala-Thr-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (Dnp) -NH2 进行定性检测将实施例2 制备得到的化合物 MOCAc-Gly-Ala-Thr-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Lys (D np) -NH2用超纯水溶解，并稀释至7. 14 μ M得溶液Α。将溶液A、Tris溶液(IOOmM Tris, ρΗ =10)和参比溶液或待测样品溶液按体积比7 2 1的比例加入离心管混合均勻得溶液 B。将溶液B放入75°C水浴锅内孵育30分钟，然后用荧光分光光度计检测溶液B在激发波长为328nm，发射波长从340nm到500nm处的荧光强度。参比溶液为不含镍离子的超纯水溶液，待测样品溶液为含有镍离子的氯化镍超纯水溶液。当待测样品溶液在390nm处的荧光强度强于参比溶液的荧光强度时，说明待测样品中含有镍离子。图7中，a曲线为不含镍离子的超纯水溶液的荧光强度曲线，b曲线为待测样品溶液含有1. 5μ M镍离子的氯化镍超纯水溶液的荧光强度曲线。
权利要求
1.一种化合物，其具有下述通式I的结构F-Gly-Ala-Xaa-Arg-His-Trp-Lys-Phe-L丨 ys-NH2Q⑴其中，Xaa 为 Ser 或 Thr ；F连接在Gly的氮上，Q连接在Lys的ε氮上；F为荧光基团，且Q为淬灭基团；或者F为淬灭基团，且Q为荧光基团；并且F与Q相互配对，从而使得所述荧光基团在所述化合物断裂前基本上被所述淬灭基团淬灭，而在镍离子的存在下，所述化合物多肽链断裂后能够发出荧光。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中荧光基团为荧光素-6-酰基，且淬灭基团为 4-(4' 二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酰基；或者荧光基团为四甲基罗丹明-6-酰基，且淬灭基团为4- G ‘ 二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酰基；或者荧光基团为7-甲氧基香豆素-4-乙酰基，且淬灭基团为2，4- 二硝基苯基。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中荧光基团为7-甲氧基香豆素-4-乙酰基， 且淬灭基团为2，4- 二硝基苯基；优选F为7-甲氧基香豆素-4-乙酰基，且Q为2，4- 二硝基本基。
4.一种用于检测待测样品中镍离子的存在或浓度的试剂，其特征在于含有权利要求1 至3中任一项所述的通式I化合物。
5.一种检测待测样品中镍离子的存在或浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤i.在溶液中将待测样品与权利要求1-3中任一项所述的通式I化合物反应的步骤； .检测溶液荧光强度的步骤。
6.根据权利要求5所述的检测待测样品中镍离子的存在或浓度的方法，其特征在于，所述溶液的溶剂选自水、乙腈、甲醇、乙醇及其组合；通式I化合物在溶液中的浓度为 0. 1-10 μ M ；所述反应的温度为25-85°C ；所述反应的时间为5分钟至2小时。
7.根据权利要求5或6所述的检测待测样品中镍离子的存在或浓度的方法，其特征在于，所述溶液为I-IOOmM的Tris水溶液，通式I化合物在溶液中的浓度为0. 5_8μΜ，所述反应的温度为40-80°C ；所述反应的时间为10-40分钟。
8.根据权利要求7所述的检测待测样品中镍离子的存在或浓度的方法，其特征在于， 所述溶液为20mM的Tris水溶液，通式I化合物在溶液中的浓度为5 μ Μ,所述反应的温度为 75°C，所述反应的时间为30分钟。
9.权利要求1-3任一项所述的化合物在制备用于检测待测样品中镍离子的存在或浓度的试剂的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测待测样品中镍离子的存在或浓度的化合物、含有该化合物的试剂、使用该化合物检测待测样品中镍离子的存在或浓度的方法，以及该化合物在制备用于检测待测样品中镍离子的存在或浓度的试剂的用途。当被检测目标中没有目标重金属离子时，此时得到的荧光强度非常弱；当被检测目标中含有与本发明的化合物结合的重金属离子时，本发明的化合物发生断裂，使得荧光强度显著增强，实现对痕量重金属离子的高灵敏度检测。
文档编号G01N21/64GK102206248SQ201110050818
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月3日 优先权日2011年3月3日
发明者吕晓利, 罗施中 申请人:北京化工大学