专利名称：一种胆固醇分子印迹膜传感电极及其检测废弃油脂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品化学领域，具体的涉及一种用于检测地沟油的胆固醇分子印迹膜传感电极。
背景技术：
我国是世界上植物油消费量最大的国家，每年产生大约200万 300万吨废弃油脂，由于提炼工艺简单，一些不法商人在利益的驱动下，将废弃食用油脂(俗称地沟油)掺入食用油进行销售。在地沟油的加工提炼过程中产生的黄曲霉毒素是一种强烈的致癌物，毒性是砒霜的100倍，地沟油中还含有大量苯并芘、二噁英等致癌物质和其它有毒物质，进入食品渠道后会对人体健康造成极大危害。现阶段国内发展起来的检测地沟油的方法有以下几种(1)电导率检测法由于油脂在烹饪过程中接触了洗涤剂、金属器皿，或长期停留在重金属环境中，因此地沟油的电导率值明显高于普通食用油，这种方法的缺陷在于只有在地沟油的添加量较高(如高于 20%)时才能检测到这种电导率的变化；(2)蓝色试纸法随着所掺地沟油的比例不断增加， 油中的氯化钠越积越多，蓝色试纸会呈现换绿色、淡黄色和亮黄色等颜色变化，但是这一方法同样受到地沟油添加比例的限制；(3)胆固醇检测法由于地沟油是多种动植物油脂混合物，动植物组织中都含有留醇，动物油脂的特征性留醇是胆固醇，而植物油中一般不含或含有极少量的胆固醇，通过测定油中胆固醇的量，即可判定植物油中是否含有动物油脂，从而判断该油是否混有废弃食用油脂。常用的针对胆固醇的测定方法有(1)色谱法液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法等，但是传统的色谱法具有投资成本高、试剂消耗量大、前处理繁琐、耗费时间较长等不足之处；(2)水解酶法感测器的反应试剂层含有催化胆固醇氧化反应的酶、具有胆固醇酯水解活性的酶和其他添加剂，这种方法涉及到对活性酶的保存，稳定性较差，保质期短。目前利用分子印迹技术发展出很多新型的固相萃取、膜分离、免疫分析、抗体模拟、色谱固定器、仿生物传感器、催化剂、合成酶等方法。分子印迹技术是指通过分子印迹聚合物对印迹分子(或称模板分子)的“记忆”效应达到分子识别的目的。在形成分子印迹聚合物时，分子印迹聚合物内部形成了许多空穴，而且空穴之间有通道相连，通道的直径与空穴的大小相近，因此通道能起到拦截非模板分子的作用。在分子印迹聚合物的复合层内，只有尺寸较小的模板分子可以通过通道，与空穴内的作用点位相互作用被识别，而结构不同的其他分子难以通过内部通道，因而不被识别。利用分子印迹复合膜分离层的这一特性，模板分子可以源源不断地从膜一侧转移到另一侧，而非模板分子则不会通过膜。由于分子印迹聚合物对模板分子的识别具有专一性，而且稳定性能好，因此其膜适合作为灵敏度较高的传感器，但是由于分子印迹膜的制备存在很多技术难点，如需要针对不同的模板分子寻找合适的功能单体；由于制备出来的膜有脆性，需要合适的交联剂来进行固化；需要要选择合适的洗脱剂，不仅要能洗去模板分子，还要能保持膜内空穴形态等，目前其实际应用还受到了很大限制。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种胆固醇分子印迹膜传感电极，并利用这种电极来检测植物油中是否掺杂了废弃油脂。本发明选择性好，灵敏度高，分析速度快，成本低，能在现场检测，可以缩减取样量、避免繁琐的样品预处理过程。本发明的技术方案如下
一种胆固醇分子印迹膜传感电极，由下述制备步骤得到
(1)取绝缘电极基片，涂覆分离的工作电极和对电极，所述工作电极为圆形，对电极为环绕工作电极的半圆环形；
(2 )在所述绝缘电极基片上对应步骤(1)的工作电极和对电极，用导电浆分别印制依次连接的工作电极连线和接线端子以及对电极连线和接线端子；
(3)在所述工作电极连线以及对电极连线表面涂覆一层绝缘层；在所述工作电极以及对电极的表面涂覆一层胆固醇分子印迹膜；
(4)所述胆固醇分子印迹膜的制备方法如下
A、称取胆固醇模板分子与功能单体溶于有机溶剂中，经过超声波震荡使其混合均勻， 再向其中加入交联剂，经过超声波震荡使其混合均勻，然后向其中加入引发剂和粘合剂，经过超声波震荡使其混合均勻，最后向该溶液中通入氮气除氧，将所得溶液密封待用；
B、将步骤A所得的溶液滴加到工作电极和对电极表面，盖玻片压盖，在365nm紫外光照射下进行聚合反应，合成含有胆固醇模板分子的薄膜；
C、将步骤B所得的承载胆固醇模板分子薄膜的电极用洗脱液进行洗脱，使胆固醇模板分子除去，直到最后一次洗脱液中检测不到胆固醇模板分子存在，得到胆固醇分子印迹膜， 将制备好的电极保存在双蒸水中备用；
上述步骤中各种试剂的添加量为胆固醇模板分子为0. iTl.2mm0l，有机溶剂为 90 120ml，功能单体为5. 8 6. Immol,交联剂为34 36mmol，引发剂为25 35mg，粘合剂 0. 04 0. 056ml ；
其中，所述电极基片的材质为聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯中的一种，其形状为片材或卷材；所述工作电极连线以及对电极连线表面涂覆的绝缘层的材质为聚氯乙烯； 所述功能单体为甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺中的一种； 所述有机溶剂为氯仿和甲苯的混合溶液，氯仿和甲苯的体积比为1:5、； 所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯； 所述所述引发剂为偶氮二异丁腈； 所述所述粘合剂为水性聚氨酯；
所述洗脱液为氯仿和乙酸的混合溶液，氯仿和乙酸的体积比为1:0. 2^0. 3 ； 将步骤A所得的溶液滴加到工作电极和对电极表面时，滴加的溶液体积为8 15ul，所形成的胆固醇分子印迹膜为圆形，其直径为5飞mm，厚度为8(Tl00Um。上述胆固醇分子印迹膜传感电极的用途，用来检测样品油中是否掺有废弃油脂， 所述样品油不需要进行预处理。本发明的检测机理为以目标分子胆固醇为模板，与功能单体接触并通过诱发聚合反应，围绕模板形成聚合物，洗脱胆固醇模板分子后，聚合物内部分布着大量胆固醇模板分子的印迹“空穴”，其在空间结构、结合位点等方面高度匹配胆固醇模板分子。用胆固醇分子印迹聚合物膜作为敏感材料，对待测样品进行检测，待测样品中的胆固醇分子能够与这种“空穴”结合，从而改变分子印迹膜的电化学性质，造成分子印迹膜的电导率增大、过膜电流增加。通过将覆盖有胆固醇分子印迹膜的电极与电流型传感器相连接，可以快速、灵敏的检测出样品中是否含有胆固醇分子。本发明有益的技术效果在于
(1)本发明采用二甲基丙烯酸乙二醇酯、氯仿和甲苯的混合溶液等亲水性溶剂作交联剂和有机溶剂，降低了分子印迹膜制备及使用过程中对溶剂的要求，所制备的聚合物可直接测试含水溶剂，扩大了材料的应用范围；
(2)本发明在胆固醇分子印迹膜的制备过程中加入了粘合剂水性聚氨酯，增加了分子印迹膜的柔韧性，防止了在聚合过程中分子印迹膜出现裂痕的现象，并使所制备的分子印迹膜内部的空穴分布均勻，十分有利于检测效果的提高；
(3)本发明通过丝网印刷技术与分子印迹聚合技术相结合获得胆固醇传感器，实现了微型化和集成化，适合于现场检测，并能避免繁琐的样品预处理过程，对于不同样品，只需替换附有胆固醇分子印迹膜的丝网印刷电极即可，通过它可以很快地判断出样品油中是否掺有废弃食用油脂，具有成本低、使用寿命长、重现性良好和特异性识别能力强等优点。
图1为本胆固醇分子印迹膜传感电极的平面结构示意图，图中1、电极基片；2、接线端子；3、电极连线；4、工作电极；5、对电极；6、绝缘层；7、胆固醇分子印迹膜。图2为本胆固醇分子印迹膜传感电极的侧视图，图中1、电极基片；6、绝缘层；7、 胆固醇分子印迹膜。图3为使用本发明进行检测时电信号的处理流程图。具体实施方法
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，本发明的保护范围不限于下述实施例。实施例1 (一)制备电极。如图1和图2所示，取绝缘电极基片1，采用采用丝网印刷技术，用导电银浆涂覆分离的工作电极4和对电极5，所述工作电极4为圆形，对电极5为环绕工作电极4的半圆环形；在所述绝缘电极基片1上对应工作电极4和对电极5，分别印制依次连接的工作电极连 3和接线端子2以及对电极连线3和接线端子2 ；在所述工作电极连线3以及对电极连线3
表面涂覆一层绝缘层6。其中，电极基片1的长度为38mm、宽10mm、厚0. 5mm ； 接线端子2的长度为10mm、宽为Imm ；
电极连线3的长度为20mm、宽为Imm ； 两条平行电极连线3之间的间距为3mm ； 工作电极4为直径Imm的实心圆形； 对电极5的外直径为4mm、内直径为2mm。在上述制备好的电极基片的工作电极4和对电极5表面涂覆一层胆固醇分子印迹膜7，所述胆固醇分子印迹膜7的制备方法如下
A、称取Immol(0. 386g)胆固醇模板分子与6mmol (0. 516g)甲基丙烯酸功能单体溶于 IOOml体积比为1 7的氯仿和甲苯混合溶液中，经过超声波震荡10分钟使其混合均勻，再向其中加入35mmol (6. 937g)二甲基丙烯酸乙二醇酯交联剂，经过超声波震荡15使其混合均勻，然后向其中加入0. 03g偶氮二异丁氰引发剂和0. 05ml水性聚氨酯粘合剂，经过超声波震荡20分钟使其混合均勻，然后向该溶液中通入氮气除氧5分钟，将所得溶液密封待用；
B、将步骤A所得的溶液滴加IOul到工作电极4和对电极5表面，盖玻片压盖，在365nm 紫外光距离18cm照射聚合15分钟，重复两次，形成含有胆固醇模板分子的薄膜；
C、将步骤B所得的承载胆固醇模板分子薄膜的电极用体积比为1:0.25的氯仿-乙酸混合溶液在索氏提取器中提取16小时，室温超声波震荡后离心收集上清液，反复洗脱胆固醇模板分子，直到最后一次上清液中检测不到胆固醇模板分子存在，将制备好的电极保存在双蒸水中备用。其中，分子印迹膜片7为直径5mm的圆形，厚度为90um。(二)制备待测油样品油。本实施例以市售金龙鱼大豆油(一级)为待测样品油。经过气相色谱法检测该样品油中不含胆固醇，为了测试本胆固醇分子印迹膜传感电极的检测效果，在样品油中加入标准胆固醇溶液，用本电极来检测加入标准胆固醇溶液后的样品油的胆固醇含量。样品油的制备方法如下
取经过气相色谱法确证不含有胆固醇的植物油样品5份，用IOml移液器移取样品5ml 放至IOml离心管中，再加入Iml含有250mg/L的胆固醇标准溶液，震荡混勻15min。样品油中胆固醇的理论浓度为
5ml不含胆固醇的样品油中加入Iml浓度为250mg/L的胆固醇标准溶液，其理论上的胆固醇含量应为(lml*250mg/L)/6ml 42mg/L = 0. 042 mg/ml，把待测油样品的密度视为 lg/ml，则样品油中胆固醇的理论含量应为0.042mg /g=42 ug/g。(三)检测样品油。取IOul经过处理的样品油滴加到本发明的分子印迹膜传感电极上，然后将其插入电流型传感器，测定并记录读数。针对于同一样品，更换分子印迹膜传感电极，连续检测 5次，以所得的平均值作为检测值。检测的工作原理如图3所示电极基上的分子印迹膜内的特异性空穴选择性的与样品油中的胆固醇分子结合，造成分子印迹膜电化学性质变化，导致恒电位激励下的电流发生变化，电流信号经电流-电压转换器转化为电压信号并放大，再经模数转换器转化为数字信号，经单片机分析处理后，数据在存储器中保存记录并可随时提取，同时胆固醇浓度直接从液晶显示电路读出，数据可通过USB接口传输到计算机做长期储存。本方法在检测样品油时，可以显示的最小胆固醇浓度为6ug/g，线性范围介于 50ug/g^2mg/g之间，即样品油中胆固醇浓度在50ug/g 2mg/g之间时，检测结果较为准确。(四)检测结果。在本实施例中，5次检测得到的样品油中胆固醇的平均含量为68ug/g，与理论胆固醇浓度值接近，在定性分析样品油中是否掺杂有地沟油时具有非常明显的定性检测的提示作用；5次检测的相对标准偏差为3. 4%，可以看出本胆固醇分子印迹膜传感电极检测的重复性良好。 把制备好的胆固醇分子印迹膜传感电极在-4°C条件下保存在双蒸水(经过两次蒸馏的纯净水)中，经过两个月之后重新检测相同的添加了胆固醇标准溶液的样品油，检测结果表明两次检测结果的相对标准偏差小于3. 9%，由此可见本胆固醇分子印迹膜传感电极在实际检测中具有良好的重复性和稳定性。
权利要求
1.一种胆固醇分子印迹膜传感电极，由下述制备步骤得到(1)取绝缘电极基片，涂覆分离的工作电极和对电极，所述工作电极为圆形，对电极为环绕工作电极的半圆环形；(2 )在所述绝缘电极基片上对应步骤(1)的工作电极和对电极，用导电浆分别印制依次连接的工作电极连线和接线端子以及对电极连线和接线端子；(3)在所述工作电极连线以及对电极连线表面涂覆一层绝缘层；在所述工作电极以及对电极的表面涂覆一层胆固醇分子印迹膜；(4)所述胆固醇分子印迹膜的制备方法如下A、称取胆固醇模板分子与功能单体溶于有机溶剂中，经过超声波震荡使其混合均勻， 再向其中加入交联剂，经过超声波震荡使其混合均勻，然后向其中加入引发剂和粘合剂，经过超声波震荡使其混合均勻，最后向该溶液中通入氮气除氧，将所得溶液密封待用；B、将步骤A所得的溶液滴加到工作电极和对电极表面，盖玻片压盖，在365nm紫外光照射下进行聚合反应，合成含有胆固醇模板分子的薄膜；C、将步骤B所得的承载胆固醇模板分子薄膜的电极用洗脱液进行洗脱，使胆固醇模板分子除去，直到最后一次洗脱液中检测不到胆固醇模板分子存在，得到胆固醇分子印迹膜， 将制备好的电极保存在双蒸水中备用；上述步骤中各种试剂的添加量为胆固醇模板分子为0. iTl.2mm0l，有机溶剂为 90 120ml，功能单体为5. 8 6. Immol,交联剂为34 36mmol，引发剂为25 35mg，粘合剂 0. 04 0. 056ml。
2.根据权利要求1所述的胆固醇分子印迹膜传感电极，其特征在于所述电极基片的材质为聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯中的一种，其形状为片材或卷材；所述工作电极连线以及对电极连线表面涂覆的绝缘层的材质为聚氯乙烯。
3.根据权利要求1所述的胆固醇分子印迹膜传感电极，其特征在于所述功能单体为甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺中的一种。
4.根据权利要求1所述的胆固醇分子印迹膜传感电极，其特征在于所述有机溶剂为氯仿和甲苯的混合溶液，氯仿和甲苯的体积比为1 5 9。
5.根据权利要求1所述的胆固醇分子印迹膜传感电极，其特征在于所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯。
6.根据权利要求1所述的胆固醇分子印迹膜传感电极，其特征在于所述所述引发剂为偶氮二异丁腈。
7.根据权利要求1所述的胆固醇分子印迹膜传感电极，其特征在于所述所述粘合剂为水性聚氨酯。
8.根据权利要求1所述的胆固醇分子印迹膜传感电极，其特征在于所述洗脱液为氯仿和乙酸的混合溶液，氯仿和乙酸的体积比为1:0. 2^0. 3。
9.根据权利要求1所述的胆固醇分子印迹膜传感电极，其特征在于将步骤A所得的溶液滴加到工作电极和对电极表面时，滴加的溶液体积为8 15ul，所形成的胆固醇分子印迹膜为圆形，其直径为5 6mm，厚度为8(Tl00um。
10.权利要求1至9所述胆固醇分子印迹膜传感电极的用途，用来检测样品油中是否掺有废弃油脂，所述样品油不需要进行预处理。
全文摘要
一种胆固醇分子印迹膜传感电极，由下述制备步骤得到(1)取绝缘电极基片，涂覆分离的工作电极和对电极，所述工作电极为圆形，对电极为环绕工作电极的半圆环形；(2)在所述绝缘电极基片上对应步骤(1)的工作电极和对电极，用导电浆分别印制依次连接的工作电极连线和接线端子以及对电极连线和接线端子；(3)在所述工作电极连线以及对电极连线表面涂覆一层绝缘层；在所述工作电极以及对电极的表面涂覆一层胆固醇分子印迹膜。本发明选择性好，灵敏度高，分析速度快，成本低，能在现场检测，可以缩减取样量、避免繁琐的样品预处理过程。
文档编号G01N27/30GK102353707SQ20111019085
公开日2012年2月15日 申请日期2011年7月8日 优先权日2011年7月8日
发明者周智慧, 朱秋劲, 毛飞君, 王捷, 赵晓联 申请人:无锡市金坤生物工程有限公司