专利名称：一种抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极的制备方法
技术领域：
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极的制备方法。
背景技术：
自从1986年Rmlds和Lowe将葡萄糖氧化酶固定在聚吡咯中构建第一支导电高分子葡萄糖氧化酶电化学生物传感器以来，导电高分子作为酶的固定化载体由于其自身的优良性能、简易的制备方法和简单操作流程等优势备受生物传感器科研工作者的广泛青睐。导电高分子用于生物传感器的活性分子固定化载体具有六大优势①具有快速的电子传递能力；②具有与生物活性分子良好的生物兼容性；③能保持生物活性分子良好的生物活性；④能有效防止生物活性分子流失；⑤能延长生物传感器的寿命；⑥能降低生物传感器的成本且易加工。传统电化学方法制备的导电高分子酶电极(酶被导电高分子膜固定在电化学电极表面的生物电极)生物兼容性差，而且对酶还有一定的毒性(M. Gerard，A. Chaubey, and B. D. Malhotra, Biosens. Bioelectron.，2002, 17，345)。结果造成检测过程中稳定性差，重现性差、灵敏度低，检测限高，检测范围小等问题，而且在实际应用中精确度也有很大影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种结构简单、灵敏度高的抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极及其制备方法。本发明的抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极的制备方法，是以 3，4-乙撑二氧噻吩、碳钠米管、1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯、十二烷基肌氨酸钠为原料， 在常规三电极体系中恒电位1. 1 V聚合60秒制备高性能导电聚(3，4-乙撑二氧噻吩)纳米薄膜复合修饰电极，预处理干燥后将抗坏血酸氧化酶缓冲液滴涂在复合修饰电极表面，自然干燥后，将碳钠米管-Nafion-疏水离子液混合液覆盖在含抗坏血酸氧化酶层的高性能导电聚(3，4-乙撑二氧噻吩)纳米薄膜复合修饰电极表面，自然干燥后，制得高性能抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极。本发明通过电化学方法将3，4-乙撑二氧噻吩与碳钠米管(纳米材料)、十二烷基肌氨酸钠(生物兼容性氨基酸表面活性剂)、1_乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯(亲水“绿色”电解质溶液)一步制得高性能导电聚(3，4-乙撑二氧噻吩)纳米薄膜复合修饰电极。该电极结合了聚(3，4-乙撑二氧噻吩)、碳钠米材料、生物兼容性氨基酸表面活性剂、亲水离子液的优点，不仅增强了聚(3，4-乙撑二氧噻吩)的生物兼容性、导电性以及生物传感电极的灵敏度和亲和力，而且还降低了检测限和检测电位，促使电子转移和加速电流响应。再通过简单的复合干燥的方法将碳纳米管分散液、Nafion、疏水离子液混合一步制得生物兼容性复合外膜，增强了酶传感器的抗干扰性、生物电催化活性、生物兼容性、稳定性及灵敏性。使用本方法制备的电化学生物传感电极不仅可以对农作物和农产品中维生素C 含量进行成功的检测，而且还具有检测效果好、响应时间短、工作电位低、选择性强、灵敏度高、检测限低、线性范围宽、亲和力强、重现性和稳定性好、寿命长等特点。
图1为本发明制备的生物传感器对维生素C的生物电催化氧化和伏安测定； 图2为本发明制备的生物传感器对维生素C的生物电催化氧化和安培测定；
图3为本发明制备的生物传感器的稳定性。
具体实施例方式
一种抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极的制备方法，包括以下步骤 1、电解质溶液的配制先将1.42 mg 3，4-乙撑二氧噻吩、2. 93 mg十二烷基肌氨酸钠、 1 mg重量百分数0.1 wt%碳钠米管分散液、2. 36 mg 1_乙基_3_甲基咪唑硫酸乙酯超声溶解于总体积1毫升的去离子水中，最后混合均勻得到电解质溶液。2、高性能导电聚(3，4-乙撑二氧噻吩)纳米薄膜复合修饰电极的制备向上述电解质溶液中通入氮气20分钟，以除去溶液中的溶解氧，采用常规三电极体系，在1. 1 V恒电位聚合60秒，一步制得聚(3，4-乙撑二氧噻吩)纳米薄膜复合修饰电极，整个过程在氮气保护下进行。3、聚(3，4-乙撑二氧噻吩)纳米薄膜复合修饰电极的预处理复合修饰电极制备结束后，将电极从电解质溶液中取出，用去离子水冲洗，以除去薄膜复合修饰电极表面上的 1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯、3，4-乙撑二氧噻吩单体和低聚物、碳钠米管、十二烷基肌氨酸钠，然后干燥备用。4、将0.3g L—1抗坏血酸氧化酶缓冲液5 μ 滴涂在聚(3，4-乙撑二氧噻吩)纳米薄膜复合修饰电极表面，并自然干燥备用。5、碳钠米管-Nafion-疏水离子液复合液的制备先将4%碳钠米管分散液、5% Nafion溶液、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸疏水离子液按体积比1:1将三者混合均勻，超声配制得到总体积0. 6毫升碳钠米管-Nafion-疏水离子液复合液。6、将碳钠米管-Nafion-疏水离子液复合液覆盖在含酶的聚(3，4_乙撑二氧噻吩) 纳米薄膜复合修饰电极表面，自然干燥得到高性能抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极。7、将制得的酶电极放入5X10_2 mol L_1含十二烷基肌氨酸钠的磷酸缓冲液(pH 6.5)中，4°C保存备用。高性能复合修饰电极的参数优化和性能评估电化学生物传感器在制备过程中的各种材料的浓度参数和在检测过程中的工作电位、成膜厚度、温度、PH値、磷酸缓冲液浓度进行优化，同时还对酶的动力学、线形范围、重现性、灵敏度、操作和保存稳定性、选择性进行了评估。酶动力学研究表明该生物传感电极具有良好的生物亲和力与酶活性(表观米氏常数2. M mM、表观最大电流密度1.045 mA cm_2)。而低的表观活化能值(7. 049 kj Μ—1)进一步证实该生物传感器具有良好的生物亲和力和酶活性。生物传感复合电极对维生素C的良好生物电催化氧化活性表明该生物传感电极能够成功检测未知维生素C含量。而且该电极对维生素C有快速响应时间(2 S)、宽的线形范围(6.0X10_8 -IXlO-3 Μ、显著的灵敏度 (187.3 mA M 1 cm 2)、低的检测限(0. 024 μΜ、低的工作电位(0 V)、良好操作稳定性(50次分析标准偏离0. 48%，13根标准偏离0. 56%)和保存稳定性(15天内无活性损失，30天内损失2.6%，60天内仍拥有80. 05%的生物活性)。大多数物质无干扰活性。另外，对商业饮料和蔬菜进行VC检测，良好的结果表明该生物传感复合电极的应用具有可行性和可操作性。
权利要求
1. 一种抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极的制备方法，其特征在于它包括以下步骤(1)、先将1.42 mg 3，4-乙撑二氧噻吩、2. 93 mg十二烷基肌氨酸钠、1 mg重量百分数 0. 1 wt%碳钠米管分散液、2. 36 mg 1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯超声溶解于总体积1毫升的去离子水中，最后混合均勻得到电解质溶液；(2 )、向上述电解质溶液中通入氮气20分钟，采用常规三电极体系，在1. 1 V恒电位聚合60秒，一步制得聚(3，4-乙撑二氧噻吩)纳米薄膜复合修饰电极，整个过程在氮气保护下进行；(3)、复合修饰电极制备结束后，将电极从电解质溶液中取出，用去离子水冲洗，然后干燥备用；(4)、将0.3g L—1抗坏血酸氧化酶缓冲液5 μ 滴涂在聚(3，4_乙撑二氧噻吩)纳米薄膜复合修饰电极表面，并自然干燥备用；(5)、将4%碳钠米管分散液、5%Nafion溶液、1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸疏水离子液按体积比1 1将三者混合均勻，超声配制得到总体积0. 6毫升碳钠米管-Nafion-疏水离子液复合液；(6)、将碳钠米管-Nafion-疏水离子液复合液覆盖在含酶的聚(3，4-乙撑二氧噻吩)纳米薄膜复合修饰电极表面，自然干燥得到高性能抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极。
全文摘要
一种抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极的制备方法，先将3,4-乙撑二氧噻吩、十二烷基肌氨酸钠、碳钠米管、1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯配制成电解质溶液，再使用三电极体系在恒电位1.1V聚合60秒一步制得导电聚(3,4-乙撑二氧噻吩)纳米薄膜复合修饰电极。然后将抗坏血酸氧化酶缓冲液滴涂在复合修饰电极表面，最后使用碳钠米管-Nafion-离子液混合液覆盖酶层，即得。本发明构建的复合修饰电极对维生素C具有良好的生物电催化活性、宽的线性范围、低的检测电位、快速的电流响应、显著的灵敏度，高的重现性和稳定性、良好的选择性，而且具有制备成本低廉、工艺简单、操作简易、固定化酶活性高、亲和力强等特点。
文档编号G01N27/327GK102507691SQ201110320160
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者刘明, 徐景坤, 文阳平, 李冬, 贺浩华 申请人:江西科技师范学院