专利名称：采用金属氧化物富集糖肽的通用方法
技术领域：
本发明涉及生化分析领域，具体地说是一种金属氧化物在富集糖肽中的应用。
背景技术：
蛋白质糖基化是一种存在最为普遍的翻译后修饰过程。约50%以上的蛋白质存在糖基化现象。蛋白质糖基化涉及到细胞免疫、受体激活、信号转导等许多生物过程。已有研究表明糖蛋白的异常与某些疾病有着密切关系。另外，一些糖蛋白由于其特殊的生物功能已经被开发成药物。因此对糖蛋白进行深入的研究可以更好的认识和解释生命现象，揭示疾病的发生过程，并且对于疾病早期诊断和新靶点药物开发具有重要作用。但由于糖蛋白样品经酶解后酶解液中糖肽丰度非常低，并且糖肽在质谱中受非糖肽的离子抑制，导致糖蛋白的结构分析非常具有挑战性。因此，在质谱分析前对糖肽进行富集是非常必要的。近年来，糖肽的富集方法主要有凝集素亲和色谱法、肼化学法、硼酸亲和色谱法及亲水作用色谱法。凝集素亲和色谱法是应用最广、选择性好，但存在糖基化覆盖率低的问题[Kubota, K.；Sato, Y.；Suzuki, Y.et al.Anal.Chem.2008,80, 3693];餅化学对糖妝的高选择性使其在高通量的N-型糖蛋白位点鉴定中获得了很好的应用，但是该方法存在糖基化覆盖率低和丢失糖链的信息等问题[Zhang, H.；Li, X.J.；Martin, D.B.；Aebersold,R.Nat.Biotechnol.2003,21,660.];硼酸亲和色谱法能与顺势二醇形成硼酸酯结构也可以用来富集糖肽，但这种方法的费时较长[Zhou, ff.；Yao, N.；Yao, G.P.；Deng, C.Η.；Zhang,X.Μ.;Yang，P.Y.Chem.Commun.2008,5577.]。亲水作用色谱可富集不同类型的糖肽，糖基化覆盖率高，但是容易受到具有相当极性的非糖肽的干扰[Wada，Y.；Tajiri, M.；Yoshida,
S.Anal.Chem.2004，76,6560.]。因此需要开发对糖肽选择性高、糖基化覆盖率广的富集方法。近年，氧化钛在亲水作用色谱模式下被用来富集含有唾液酸的糖肽和中性糖肽[Yan, J., Li, X., Yu, L.，Jin, Y.，et al.，Chem.Commun.2010,46, 5488]。该方法可以实现糖肽的高选择性富集，但是不同的糖肽需要不同的冲洗和洗脱条件，导致方法的通用性不够，不适合未知的、复杂样品。另外，氧化钛在亲水作用色谱模式下富集糖肽，所采用的上样条件是中性、冲洗条件和洗脱条件都酸性。因此针对氧化钛材料需要开发通用性的糖肽富集方法，采用酸性的上样条件和碱性的淋洗条件和洗脱条件，以便于实际复杂生物样品的分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有具有选择性高、糖基化覆盖率广、通用性广、操作简单和重复性好的糖肽富集方法，能对痕量糖肽进行选择性富集。具体操作时采用萃取模式模式，过程如下:I)将氧化钛装入萃取柱中，采用冲洗液平衡柱子，将糖蛋白酶解物(pH2-6)上到柱上，金属氧化物材料与糖蛋白酶解物重量比例为10-200: I ；
2)采用2-50倍金属氧化物材料柱体积的pH 7-10的0_50 %淋洗溶液冲洗，去处非糖肽；重复此步骤1-10次；3)采用2-50倍金属氧化物材料柱体积的pH 10.1-14的0_50%洗脱溶液洗脱糖肽。重复此步骤1-10次。具体操作时采用离心模式，过程如下；I)将糖蛋白酶解物(pH 2-6)直接与金属氧化物(材料与糖蛋白酶解物质量比例为10-200: I)混合，孵化0.5分钟-1小时，离心，弃上层溶液，收集沉淀；2)离心后的金属氧化物与2 50倍材料柱体积的pH为7_10的0_50%淋洗溶液混合，孵化0.5分钟-1小时，离心，弃上层溶液，收集沉淀；重复此步骤1-10次；3)离心后的金属氧化物与2 50倍材料柱体积的pH为10.1-14的0_50%洗脱溶液混合，孵化0.5分钟-1小时，离心，收集上清液，得到糖肽。重复此步骤1-10次。本发明具有如下优点:1.本发明的优点在于金属氧化物富集糖肽时表现出了高选择性、高糖基化覆盖率、通用性广等特点，可以实现糖肽的有效富集；2.本发明涉及的金属氧化物既可以方便的装填成不同长度，不同内径的柱子，又可以直接添加与离心管，操作简单，易于重复。特别适合微量生物样品中糖肽段的富集；3.本发明富集得到的糖肽可直接用于电喷雾-质谱分析(ES1-MS)或者基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALD-TOF MS)，提高了质谱的检测限和灵敏度。
图1商品化氧化钛微球对标准糖蛋白转铁蛋白酶解产物中糖肽富集前后的电喷雾质谱图。(a)经氧化钛富集后的质谱图；(b)未经富集的质谱图。糖肽标示为星号。图2商品化氧化钛微球对标准糖蛋白胎球蛋白的酶解产物中糖肽富集前后的电喷雾质谱图。(a)未经富集的质谱图；(b)经氧化钛富集后的质谱图。糖肽标示为星号。
具体实施例方式本发明的目的在于提供一种金属氧化物富集糖肽的方法，该方法可在固相萃取模式或者离心模式下进行，具有操作简单，通量高和重复性好等优点。下面结合附图通过具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不受这些实施例的限制。本发明以下实施例所使用的一种金属氧化物材料为商品化氧化钛(GLSciences，东京，日本)O样品溶液的制备:lmg的单一标准糖蛋白(包括转铁蛋白和肽球蛋白)溶解于ImL8M尿素/50mM碳酸氢铵溶液中(pH 8.2，)，温育4h，加入4 μ L 50mM的二硫苏糖醇溶液在37°C反应2h。加入4yL 50mM的碘代乙酸，室温避光静置30min，经过上述处理，蛋白完全变性，二硫键被打开，巯基被封闭。再按照蛋白与胰蛋白酶的质量比40: I (w/w)的比例加入胰蛋白酶进行酶解37V反应16小时。实施例1将Img氧化钛装入凝胶吸头中，10μ L转铁蛋白蛋白酶解液(见样品溶液的制备)(pH 3)上样后，分别用30 μ L体积浓度为0.25%氨水溶液洗脱两次(pH 10);最后用30 μ L含有体积浓度为10%氨水溶液(PH= 12)洗脱两次，得到糖肽。富集后的糖肽用质谱进行分析。由图1可见，转铁蛋白酶解产物中的糖肽能被氧化钛特异性的富集和纯化。实施例2调整富集的操作模式为离心，将Img氧化钛装入离心管中，与5μ L肽球蛋白酶解液(pH 3)混合，孵化5min，离心后收集沉淀；沉淀再用30 μ L的体积浓度为10%CH3CN/0.1 % NH4OH (pH 10)孵化5min，收集沉淀。沉淀与30 μ L含有体积浓度为0.25%氨水溶液(PH = 10)孵化5min，离心后收集沉淀，重复此孵化和离心步骤2次；最后沉淀与30 μ L含有体积浓度为10%氨水(PH= 12)孵化5min，离心后收集上清液，得到糖肽。各上清液直接在MALD1-T0F质谱上分析。由图2可见，胎球蛋白酶解产物中糖肽被氧化钛异性性的富集和纯化。实施例3-6调整金属氧化物材料的重量为2mg、3mg、6mg、10mg,其他条件同实施例1,富集后得到的糖肽进行质谱分析，实验结果表明在萃取模式操作模式下Img的材料可以有效地保留和富集糖蛋白标准品酶解液中的糖妝。实施例7-10调整蛋白酶解液的上样量为20pmol、40pmol、80和200pmol，其他条件同实施例1，富集后得到的糖肽进行质谱分析，实验结果表明在萃取模式操作模式下Img的材料可以有效地保留和富集80pmol的蛋白中的糖肽。实施例11-14调整洗脱溶液的氨水体积浓度为5%、12%、15%和20%，其他条件同实施例1，进行选择性富集和质谱分析。实施例15-18调整洗脱溶液的体积为50 μ L、100 μ L、150 μ L和200 μ L，其他条件同实施例1，进
行选择性富集和质谱分析。实施例19-22调整金属氧化物材料的重量为2mg、3mg、6mg、10mg，其他条件同实施例2，富集后得到的糖肽进行质谱分析，实验结果表明在离心操作模式下Img的材料可以有效地保留和富集蛋白中的糖肽。实施例23-25调整蛋白酶解液的上样量为20pmol、40pmol和160pmol，其他条件同实施例2，富集后得到的糖肽进行质谱分析，实验结果表明在离心操作模式下Img的材料可以有效地保留和富集蛋白中的糖肽。实施例26-29调整洗脱溶液氨水体积浓度为5%、12%、15%和20%，其他条件同实施例2，进行选择性富集和质谱分析。实施例30-33调整洗脱溶液的体积为50 μ L、100 μ L、150 μ L和200 μ L，其他条件同实施例2，进
行选择性富集和质谱分析。本发明氧化钛对于糖肽具有很好的选择性富集性能，和常规的亲水作用色谱材料相比，氧化钛富集糖肽具有更高选择性，更高糖肽回收率和更好的重复性。利用氧化钛对于糖肽的高效的特异性吸附能力，可以将其应用于复杂体系中糖肽的选择性富集，结合质谱，该材料在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域具有广阔的应用前景。
权利要求
1.利用金属氧化物富集纯化糖肽的通用方法，其特征在于: 采用金属氧化物材料与糖蛋白酶解物接触，调整淋洗和洗脱条件，选择性富集糖肽； 所述金属氧化物材料包括氧化钛、氧化锆、氧化铝、或者这些金属的复合金属氧化物中的一种或二种以上，金属氧化物材料的粒径大小为0.2-100微米，孔道直径大小为1-100纳米; 这些金属的复合金属氧化物是指金属钛、锆、铝中二种或三种的复合金属氧化物。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于: 具体操作采用固相萃取模式或离心模式； 在固相萃取(SPE)模式下采用金属氧化物材料富集糖肽时，将糖蛋白酶解物上到以金属氧化物材料为填料的SPE柱上，采用淋洗溶液冲洗去除非糖肽后，利用洗脱溶液富集出糖肽； 或在离心模式下采用金属氧化物材料富集糖肽时，将糖蛋白酶解物与金属氧化物直接混合，采用淋洗溶液在离心方式下去除非糖肽后，利用洗脱溶液在离心方式下富集出糖肽。
3.按照权利要求2所述糖肽富集方法，其特征在于: 样品的上样量为金属氧化物材料与糖蛋白酶解物质量比例为3-200: 1，上样溶液的pH为2-6 ;富集温度为15-60°C;糖蛋白可以是免疫球蛋白、胎球蛋白、核糖核酸酶B和转铁蛋白中一种或二种以上。
4.按照权利要求2或3所述糖肽富集方法，其特征在于: 去除非糖肽时采用的淋洗溶液是体积浓度为O - 5 O %的乙腈、甲醇或乙醇溶液，P H7-10 ； 洗脱糖肽是采用的洗脱溶液是体积浓度为0-50%的乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH10.1-14。
5.按照权利要求4所述糖肽富集方法，其特征在于: 采用2 50倍金属氧化物材料柱体积的淋洗溶液去除非糖肽，淋洗2-20次； 采用2 50倍金属氧化物材料柱体积的洗脱溶液富集糖肽，洗脱2-20次。
6.按照权利要求2所述糖肽富集方法，其特征在于: 采用离心模式， 1)糖蛋白酶解物直接与金属氧化物材料孵化时间0.5分钟-1小时，离心，弃上层溶液，收集沉淀； 2)离心后的金属氧化物材料与淋洗溶液孵化时间0.5分钟-1小时，离心，收集沉淀；此过程重复1-10次； 3)离心后的金属氧化物材料与洗脱溶液孵化时间0.5分钟-1小时，离心，收集上清液；此过程重复1-10次。
7.按照权利要求2所述糖肽富集方法，其特征在于: 采用萃取模式， 1)将氧化钛装入萃取柱中，采用冲洗液平衡柱子，将PH2-6糖蛋白酶解物上到柱上，金属氧化物材料与糖蛋白酶解物重量比例为10-200: I ； 2)采用2-50倍金属氧化物材料柱体积的pH7-10的0-50%淋洗溶液冲洗，去处非糖肽；重复此步骤1-10次；3)采用2-50倍金属氧化物材料柱体积的pH 10.1-14的0-50%洗脱溶液洗脱糖肽；重复此步骤1_10次。`
全文摘要
本发明涉及生化分析领域，公开了一种富集糖肽的方法。本方法使用金属氧化物为富集材料，通过优化上样、淋洗和洗脱条件，实现了对糖肽的选择性富集。该方法具有糖肽选择性高、糖基化覆盖率广、通用性广、操作简单和重复性好等优点，适用于复杂体系中糖肽的选择性富集，结合质谱，该方法在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域具有广阔的实用前景。
文档编号G01N1/40GK103105327SQ20111035823
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者李秀玲, 闫竟宇, 梁鑫淼 申请人:中国科学院大连化学物理研究所