专利名称：一种血浆hsp70抗体检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于抗体检测技术领域，具体涉及一种血浆HSP70抗体检测试剂盒。
背景技术：
热休克蛋白家族(HSPs)是一类高度保守的蛋白，HSP70是热休克蛋白家族中的重要成员，其分为诱导型的组成型的。当机体受到外界环境中多种不良因素刺激时，诱导型的HSP70蛋白表达升高。HSP70蛋白对细胞损伤的修复、存活和维持正常的细胞功能是必需的。在环境刺激、病原菌感染、疾病引起细胞应激损伤中发挥分子伴侣作用，阻止蛋白聚集，促进损伤蛋白的重新折叠。在大多数的哺乳动物，只有在应激条件下诱导型HSP70表达，而且显著的细胞和机体应激后才能检测到，但是在人和灵长类，诱导型的HSP70有一个基准值，在一些特殊条件下如过热、化学有毒物质暴露、缺氧、缺血、感染、自身免疫性疾病、 凋亡、器官移植、细菌和病毒引起的感染，动脉粥样硬化等心血管疾病中，生物体的HSP70 表达显著升高；在正常老化过程，精子发生，月经，运动练习等正常生理过程中，生物体的 HSP70表达也显著升高，提示其在这些过程中可能发挥重要作用。研究者发现在很多疾病的发生、形成、预后过程中Hsps的自身抗体显著改变，提示HSP70抗体在这些过程中可能具有重要作用。一般认为诱导型的HSP70是细胞内的蛋白，但是研究发现在正常人的外周循环和一些疾病状态下能够检测到可溶性的HSP70和HSP70抗体，细胞内的HSP70能够释放到细胞外，引起机体产生HSP70抗体。近来的研究发现在各种风湿性疾病和自身免疫性疾病，HSP70能够被机体识别，产生自身抗体；人群流行病学研究发现HSP70抗体与动脉粥样硬化的进展和严重程度密切相关。所以建立快速、可靠的检测血中HSP70抗体的方法，将为多种疾病的监控提供重要的手段。现在检测HSP70抗体的方法主要有Wfestern Blotting、 Elisa方法。各种方法互相印证，同时又存在检测灵敏度、专业性、设备设施条件及成本的影响。目前，以血清学反应原理为基础的酶联免疫吸附吸附测定(Elisa)是被广泛接受和推广的方法。1969年，Avrameas将酶联抗体应用于学清学技术，1971年Engvall和Perlmann将该方法进一步完善发展了 ELISA方法。1974年Voller等将ELISA技术应用于人和动物的抗体检测。之后，此方法进一步发展，广泛应用于人和动物的体液蛋白检测。与其他检测方法相比，ELISA检测方法具有成本低、检测设施设备简单、快速高效的特点，并在不断改进当中，已经有直接ELISA、间接ELISA、单抗体ELISA，微波ELISA、双抗体夹心ELISA方法。目前市售的检测HSP70抗体试剂盒主要是美国的Stressgen公司的HSP70抗体检测试剂盒， 其基本上垄断了 HSP70抗体检测试剂盒的市场；目前Mressgen公司市售的检测HSP70抗体的试剂盒一个检测盒中的96孔板的价格约5000元人民币约测定样品50个，每个样品检测费用约100元人民币。我国这方面的销售公司大部分是代理或者进口分装的，也有偶有自行研制的报道，但是其检测灵敏度低，检测范围窄，远没有达到生产检测的程度
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种检测灵敏度高、准确性强、高效的血浆HSP70抗体检测试剂盒。一种血浆HSP70抗体检测试剂盒，该试剂盒包括固化HSP70蛋白的酶标板、HSP70 单克隆抗体标准品、辣根酶标记的抗体、抗体稀释液、洗涤缓冲液、底物显色液A液、底物显示液B液和终止液；所述HSP70单克隆抗体标准品是用下述方法制成(1)HIS-HSP70蛋白重组表达先设计上游引物5，-CGGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG-3，，下游引物5，-CCCAAGCT TCTAATCCACCTCCTCGAT-3’ ;PCR扩增，双酶切连入PET-3M载体中，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，纯化，SDS胶鉴定纯度，透析后冷冻干燥，即制成HIS-HSP70重组蛋白，分装，-70°C冻存；Q)HSP70单克隆抗体标准品制备用ang/ml的HIS-HSP70重组蛋白作为免疫抗原，选用18_20g的Balb/c雌鼠作为免疫动物，并取其脾细胞与SP2/0细胞融合，ELISA筛选、亚类鉴定、腹水制备，纯化HSP70单克隆抗体，对纯化抗体进行蛋白定量，分装，制成HSP70单克隆抗体标准品；所述固化HSP70蛋白的酶标板是用下述方法制成用HIS-HSP70重组蛋白作为包被抗原，以含浓度为1 μ g/ml的重组HIS-HSP70重组蛋白的包被液包被酶标板，4°C过夜，洗板三次，拍干，4°C保存。所述抗体稀释液的组成为每5ml含有NaCl 0. 025g, KCl 0. 00125g, KH2PO4O. 00125g, Na2HPO4O. 009g，余量为水。所述洗涤缓冲液的组成为每IOOml含有NaCl 5g，KCl 0. 125g，KH2PO4O. 125g， Na2HPO4 1.81g，吐温-20 20μ1，余量为水。所述底物显色液A液的组成为每20ml含有醋酸钠0. 544g,柠檬酸0. 064g,体积百分浓度为30%的H2A 12μ1，余量为水。所述底物显色液B液的组成为每20ml含有EDTA-Na 0. 008g，柠檬酸0. 038g，丙三醇anl，四甲基联苯胺0. 008g，余量为水，避光保存。所述终止液的组成为每20ml含有1. 15ml，余量为水。本发明的有益效果检测灵敏度高，准确性强、成本低，可以同时检测组织提取液、 血浆和血清中的HSP70抗体；随着研究的深入，血浆HSP70抗体可能会作为疾病的预警分子标记物和疾病预防的药物靶标，本试剂盒将会更多的应用于临床检测，试剂盒将有更大的应用前景。
图1包被HIS-HSP70重组蛋白的酶标板制备流程。图2HSP70单克隆抗体制备流程。 图3标准品HSP70单克隆抗体纯化蛋白电泳图；图中，M为ftOtein Marker ；1为HSP70单克隆抗体辛酸-硫酸铵纯化蛋白；2为 Protein G纯化柱纯化HSP70单克隆抗体。图4HSP70抗体检测试剂盒检测灵敏度和检测范围曲线。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1HSP70抗体检测试剂盒的组成血浆HSP70抗体检测试剂盒，该试剂盒包括固化HSP70蛋白的酶标板、HSP70单克隆抗体标准品、辣根酶标记的抗体、抗体稀释液、洗涤缓冲液、底物显色液A液、底物显示液 B液和终止液；其中，辣根酶标记抗体0. 5ml，用前体积比1 1000稀释；抗体稀释液的组成为每 5ml 含有 NaCl 0. 025g, KC10. 00125g, KH2PO4 0. 00125g, Na2HPO4 0. 009g，余量为水； 洗涤缓冲液的组成为每 IOOml 含有 NaCl 5g，KCl 0. 125g, KH2PO4 0. 125g, Na2HPO4 1. 81g， 吐温-20 20 μ 1，余量为水；底物显色液A液的组成为每20ml含有醋酸钠0. M4g，柠檬酸 0.064g，体积百分浓度为30%的H2A 12 μ 1，余量为水；底物显色液B液的组成为每20ml 含有EDTA-Na 0. 008g,柠檬酸0. 038g,丙三醇2ml，四甲基联苯胺0. 008g,余量为水，避光保存；终止液的组成为每20ml含有&S041. 15ml，余量为水。实施例2HIS-HSP70重组蛋白制备和纯化HIS-HSP70重组蛋白是用下述方法制成1.)先设计PCR扩增引物上游5‘CGGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG 3，下游5‘CCCAAGCTTCTAATCCACCTCCTCGAT 3，然后进行PCR扩增，扩增条件是950C 4min ；95°C 30s 56°C 60s 72°C 60s(30cycle) ；72°C IOmin0经EcoRI和HinDIII双酶切后连入质粒PET_32a。2.)重组质粒转化大肠杆菌BL2137°C振摇，OD值0. 5时加入IPTG 0. 5 μ 1/ml，诱导4h，超声破碎，离心收集上清。3.)将收集的上清液按GE公司的HISTrap纯化试剂盒操作说明进行纯化。经过摸索最佳的纯化条件为1ml纯化柱，柱平衡液平衡6ml——上样(Iml上清液，流速0. 5ml/ ml)——柱洗涤液洗涤8ml——20mmol/L咪磋洗脱液洗脱8ml——300mmol/L咪磋洗脱液洗脱一一收集2-細1洗脱液。4.)将收集到的洗脱液取100μ 1 SDS胶鉴定纯度，其余装入透析袋中，PBS液中透析过夜，其间换液三次。5.)将透析袋中的液体分装入冷冻干燥管中，每管中总蛋白量为lmg，冷冻干燥成粉末状，放入_70°C备用。重组HSP70蛋白纯度及含量检测分别采用SDS胶鉴定和考马斯亮蓝染色法。具体方法为将纯化时300mmol/L咪磋洗脱液取80μ 1，加5X上样缓冲液20，100°C变性5min， IOOOOg离心，取上清10 μ 1上样，10% SDS胶，80v，10min，180v，45min ；考染脱色，胶图分析。结果重组HSP70蛋白纯度> 95%，如图3所示。 实施例3固化HSP70蛋白的酶标板的制备对所得的HIS-HSP70蛋白进行酶标板包被，具体步骤为(1)取纯化的HIS-HSP70重组蛋白，用包被缓冲液稀释成lmg/ml，4°C保存，备用。
(2)将上述液体包被酶标板，每孔加液体100 μ 1，4°C过夜。(3)洗板三次，拍干；每孔加150μ 1 10%胎牛血清封闭液，4°C封闭过夜。(4)洗板三次，拍干，4°C存放，备用。对所得到的包被有HI S-HSP70蛋白的酶标板进行分析，将纯化的HSP70单克隆抗体稀释成 lmg/ml，0. lmg/ml，0. 01mg/ml，0. 001mg/ml，0. 0001mg/ml，0. OOOOlmg/ml, 0. 00000lmg/ml,以ELISA方法测定酶标板的灵敏度。结果经过蛋白纯化、包被后，得到酶标板，最低检出度(检测灵敏度)达到0. 1-0. OOlngo在组装本发明所述的试剂盒时，酶标板一块(96孔，包被HIS-HSP70蛋白)，4°C保存，不宜反复冻融，有效期一年。实施例4HSP70单克隆抗体标准品的制备用ang/ml的所述HIS-HSP70蛋白作为免疫抗原，选用18_20g的Balb/c雌鼠作为免疫动物，并取其脾细胞与SP2/0细胞融合，ELISA筛选、然后对单克隆抗体亚类鉴定， 腹水制备，纯化单克隆抗体，对所得的单克隆抗体进行分析，间接ELISA测定抗体效价为 1 20000。对所得的单克隆抗体进行辛酸-硫酸铵沉淀和ftOtein G两部纯化，纯化抗体采用SDS胶鉴定HSP70单克隆抗体纯度；采用的Brad-Ford法测定抗体浓度。试剂盒中HSP70 单克隆抗体是阳性对照，分装成100 μ g/管，-70°C保存，使用时可用不同体积的PBS或蒸馏水溶解、稀释即可使用。实施例5HSP70抗体检测采用实施例1所述的试剂盒进行HSP70抗体检测，具体方法如下1.将HSP70单克隆抗体标准品阳性对照用Iml样品稀释液稀释成10 μ g/ml，进一步稀释成 50，12. 5,3. 125,0. 78,0. 195ng/ml。2.加样分别设空白孔、5个标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100μ 1，37°C，30分钟。2.弃去液体，PBST洗涤三次，拍干。3.每孔加酶标抗体100 μ 1，37°C，20分钟。洗涤缓冲液洗板3次，350 μ 1/每孔/
次，拍干。4.依序每孔加底物显色液AB各90 μ 1，37 °C避光显色15分钟。5.依序每孔加终止溶液90 μ 1，终止反应。用酶标仪在450nm波长读数(0D值)。实施例6本实施例的目的确定本试剂盒检测的检测范围和灵敏度。材料实施例1所述血浆HSP70抗体检测试剂盒。方法取阳性对照标准品与PBS配成1 μ g/ml，倍比稀释成10个管，按实施例6中的方法进行，双复孔测定。结果如图4所示，本试剂盒检测HSP70的灵敏度195pg/ml，检测范围是390pg 50000pg/ml
权利要求
1.一种血浆HSP70抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括固化HSP70蛋白的酶标板、HSP70单克隆抗体标准品、辣根酶标记的抗体、抗体稀释液、洗涤缓冲液、底物显色液 A液、底物显示液B液和终止液；所述HSP70单克隆抗体标准品是用下述方法制成(DHIS-HSP70蛋白重组表达先设计上游引物5，-CGGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG-3，，下游引物5，-CCCAAGCTTCTA ATCCACCTCCTCGAT-3，;PCR扩增，双酶切连入PET-32a载体中，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达， 纯化，SDS胶鉴定纯度，透析后冷冻干燥，即制成HIS-HSP70重组蛋白，分装，_70°C冻存；(2)HSP70单克隆抗体标准品制备用ang/ml的HIS-HSP70重组蛋白作为免疫抗原，选用18_20g的Balb/c雌鼠作为免疫动物，并取其脾细胞与SP2/0细胞融合，ELISA筛选、亚类鉴定、腹水制备，纯化HSP70单克隆抗体，对纯化抗体进行蛋白定量，分装，制成HSP70单克隆抗体标准品；所述固化HSP70蛋白的酶标板是用下述方法制成用HIS-HSP70重组蛋白作为包被抗原，以含浓度为1 μ g/ml的重组HIS-HSP70重组蛋白的包被液包被酶标板，4°C过夜，洗板三次，拍干，4°C保存。
2.根据权利要求1所述一种血浆HSP70抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液的组成为每 5ml 含有 NaCl 0. 025g, KCl 0. 00125g, KH2PO4O. 00125g, Na2HPO4O. 009g，余量为水。
3.根据权利要求1所述一种血浆HSP70抗体检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液的组成为每 IOOml 含有 NaCl 5g，KCl 0. 125g，KH2PO4O. 125g，Na2HPO4L 81g，吐温-2020 μ 1，余量为水。
4.根据权利要求1所述一种血浆HSP70抗体检测试剂盒，其特征在于，所述底物显色液A液的组成为每20ml含有醋酸钠0. 544g，柠檬酸0. 064g，体积百分浓度为30 %的 Η20212 μ 1，余量为水。
5.根据权利要求1所述一种血浆HSP70抗体检测试剂盒，其特征在于，所述底物显色液B液的组成为每20ml含有EDTA-Na 0. 008g，柠檬酸0. 038g，丙三醇^il，四甲基联苯胺 0. 008g，余量为水，避光保存。
6.根据权利要求1所述一种血浆HSP70抗体检测试剂盒，其特征在于，所述终止液的组成为每20ml含有H2SO4L 15ml，余量为水。
全文摘要
本发明公开了属于抗体检测技术领域的一种血浆HSP70抗体检测试剂盒。该试剂盒包括固化HSP70蛋白的酶标板、HSP70单克隆抗体标准品、辣根酶标记的抗体、抗体稀释液、洗涤缓冲液、底物显色液A液、底物显示液B液和终止液。本发明的试剂盒检测灵敏度高，准确性强、成本低，可以同时检测组织提取液、血浆和血清中的HSP70抗体。
文档编号G01N33/577GK102507950SQ20111037663
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者冷雪, 战锐, 钱令嘉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所