专利名称：定量检测血浆肾素用磁微粒化学发光试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医用诊断试剂技术领域，尤其是涉及一种定量检测血浆肾素用磁微粒化学发光试剂盒。
背景技术：
肾素(renin)是肾小球旁器、球旁细胞释放的一种蛋白水解酶。肾素经肾静脉进入血液，能催化血浆中的血管紧张素原(在α 2球蛋白中)转变成血管紧张素I (10肽)，血液和肺组织中的转换酶使血管紧张素I降解为血管紧张素II (8肽)，后者可被氨基肽酶水解为血管紧张素111(7肽)。这三种血管紧张素均有生物活性，其中血管紧张素II、ΙΙΙ的生物活性较强，而后者在血中的浓度较低，故以血管紧张素II的生物活性最强。血管紧张素原和转换酶等经常存在于血浆中，肾素的释放是决定血浆中血管紧张素浓度的关键性条件。血浆肾素含量的检测，可用于诊断由于肾动脉狭窄导致的高血压或肾血管性高血压，帮助临床医生决定是否进行肾血管的影像学研究，诊断原发性醛固酮增多症，以及为原发性高血压病人心血管系统的并发症的发生提供有效的信息等。另外对于指导用药和治疗效果的评价有很重要的意义，例如，对于一些肾上腺功能低下并采用类固醇激素替代治疗的病人，当治疗效果充足时，肾素水平正常，当治疗效果不足时，肾素水平过高。肾素活性-血管紧张素II-醛固酮，在临床应用中，通常被称为高血压三项。目前对于肾素含量的检测，常通过检测血浆中血管紧张素I的浓度，来间接衡量肾素含量，称之为肾素活性。肾素活性的测定是由于血浆样本内的肾素在一定PH值和反应时间内，将样本中内源性的血管紧张素原转化为血管紧张素I，采用竞争法检测样本中的血管紧张素I的浓度，根据单位时间内生成血管紧张素I浓度的不同，来计算血浆样本的肾素活性，肾素活性的这种测定方法对标本处理、环境条件、PH值、时间等都要求极为苛刻，室内及室间重复性差。对于直接测定肾素浓度的方法目前还鲜有报道，特别是采用均相的磁微粒发光技术， 国内外尚未有该技术的建立。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量检测血浆肾素用磁微粒化学发光试剂盒，该试剂盒直接用抗肾素抗体作为包被和标记，测定血浆中的肾素含量，实现了肾素含量的直接评价。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明所述的定量检测血浆肾素用磁微粒化学发光试剂盒，包括偶联有抗肾素抗体的磁微粒混悬液、校准品、辣根过氧化物酶标记的抗肾素单克隆抗体、化学发光底物Α、化学发光底物B以及洗液。所述磁微粒混悬液中的抗肾素抗体为小鼠抗肾素单克隆抗体，磁微粒为表面含有羧基的活性基团。所述校准品是以0. 05Μ的Tris_NaCl、l%的EDTA_Na2、和m的牛血清白蛋白组成PH7. 4的缓冲液为基质，加入肾素纯品配制而成，校准品形态为液态且具有良好的稳定性。辣根过氧化物酶标记的抗肾素单克隆抗体为大鼠抗肾素单克隆抗体，该抗肾素单克隆抗体是以0. OlM的PBS和1%酪蛋白作为缓冲液基质，工作浓度为1:1000。所述化学发光底物A由Luminol 0. 15mM、羟基香豆素0. 59 mM、没食子酸0. 35 mM、 Tris-HCl缓冲液0. 2M组成，最后调pH7. 4 ；化学发光底物B由0. 2M乙酸-乙酸盐缓冲液、 维生素C 0. 12 mM、氨基酸氧化酶0.85 mM组成，最后调pH7. 4。本发明的优点在于采用双抗体夹心法联合磁微粒化学发光技术，直接采用抗肾素抗体作为包被和标记，测定血浆中的直接肾素含量，实现了肾素含量的直接评价；本发明试剂盒实现了操作的简便性和自动化性，具有检测时间短、灵敏度高、稳定性好、结果准确、变异性小的特点。
图1是本发明试剂盒检测血浆肾素的校准曲线图。
具体实施例方式本发明所述的定量检测血浆肾素用磁微粒化学发光试剂盒，包括偶联有抗肾素抗体的磁微粒混悬液、校准品、辣根过氧化物酶标记的抗肾素单克隆抗体、化学发光底物A、化学发光底物B以及洗液。偶联有抗肾素抗体的磁微粒混悬液中的抗肾素抗体为鼠抗肾素单克隆抗体，磁微粒为表面含有羧基的活性基团；采用双抗体夹心法，所用的两株配对抗体均为鼠抗肾素单克隆抗体，因此具有优异的特异性；磁微粒混悬液采用氨基戊二醛法制备，通过化学键联结磁性微粒和肾素抗体，肾素抗体的浓度控制在0. 30ug/人份，以0. OlM的PBS和1%BSA作为缓冲体系和保护体系；
所用的校准品是以0. 05M的Tris-NaCl、l%的EDTA_Na2、和m的牛血清白蛋白组成 PH7. 4的缓冲液为基质，加入肾素纯品配制而成，校准品形态为液态。辣根过氧化物酶标记的抗肾素单克隆抗体为大鼠抗肾素单克隆抗体，用0. OlM的 PH7. 4的PBS和1%酪蛋白组成的稀释液将其稀释至工作浓度1 1000。化学发光底物A由Luminol 0. 15mM、羟基香豆素0. 59 mM、没食子酸0.35 mM、 Tris-HCl缓冲液0. 2M组成，最后调pH7. 4 ；化学发光底物B由0. 2M乙酸-乙酸盐缓冲液、 维生素C 0. 12 mM、氨基酸氧化酶0. 85 mM组成，最后调pH7. 4。洗液由0. IM磷酸盐缓冲液和l%TWeen20配制而成，使用时用蒸馏水20倍稀释。本发明试剂盒使用操作程序如下
1、在反应杯中依次加入100μ 1校准品及待测样本；
2、在上述反应杯中再加入磁微粒混悬液20μ1 ；
3、将反应杯中的溶液混合均勻，37°C温育15分钟；
4、使用磁分离器洗涤设备，将反应杯中的磁微粒用洗液洗涤3次；
5、在反应杯中加入酶标记物50μ1，37°C温育15分钟；
6、使用磁分离器洗涤设备，将反应杯中的磁微粒用洗液洗涤3次；7、加入发光底物A和发光底物B各50μ 1，混勻后室温避光反应5分钟；
8、使用化学发光检测仪检测发光信号值并记录；
9、采用四参数拟合方式，建立定标曲线，计算测定结果。使用本发明试剂盒按照上述程序检测血浆肾素浓度，所用时间较短，测定结果仅需45分钟即可得出，方便快捷，且准确性高、重复性好。本试剂盒检测血浆肾素可达到如下指标
校准曲线范围0pg/ml — 500pg/ml ；
校准曲线线性浓度值和检测发光值以四参数拟合方式进行线性拟合，线性系数R > 0. 999，见图1 ；图1原始数据，用四参数拟合，X为浓度值，Y为发光值取log;
权利要求
1.一种定量检测血浆肾素用磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于它包括偶联有抗肾素抗体的磁微粒混悬液、校准品、辣根过氧化物酶标记的抗肾素单克隆抗体、化学发光底物 A、化学发光底物B以及洗液。
2.根据权利要求1所述的定量检测血浆肾素用磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于 所述磁微粒混悬液中的抗肾素抗体为小鼠抗肾素单克隆抗体，磁微粒为表面含有羧基的活性基团。
3.根据权利要求1所述的定量检测血浆肾素用磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于 所述校准品是以0. 05M的Tris-NaCl、l%的EDTA_Na2、和m的牛血清白蛋白组成pH7. 4的缓冲液为基质，加入肾素纯品配制而成，校准品形态为液态。
4.根据权利要求1所述的定量检测血浆肾素用磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于 所述辣根过氧化物酶标记的抗肾素单克隆抗体是大鼠抗肾素单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的定量检测血浆肾素用磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于 所述化学发光底物A由Luminol 0. 15mM、羟基香豆素0. 59 mM、没食子酸0. 35 mM,Tris-HCl 缓冲液0. 2M组成，最后调pH7. 4 ；化学发光底物B由0. 2M乙酸-乙酸盐缓冲液、维生素C 0. 12 mM、氨基酸氧化酶0. 85 mM组成，最后调pH7. 4。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测血浆肾素用磁微粒化学发光试剂盒，包括偶联有抗肾素抗体的磁微粒混悬液、校准品、辣根过氧化物酶标记的抗肾素单克隆抗体、化学发光底物A、化学发光底物B以及洗液。本试剂盒采用均相的磁微粒发光技术和抗体夹心法直接测量血浆中的肾素浓度，具有检测时间短、灵敏度高、稳定性好、结果准确、变异小的特点，本试剂盒替代了肾素活性的检测，直接测定血浆中肾素的含量，实现了肾素含量的直接评价。
文档编号G01N33/577GK102565037SQ20121000688
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者付光宇, 刘功成, 吴学炜, 李文娟, 渠海, 王敏, 秦东春, 赵鹏, 郑立运, 陆莹, 陈科, 马建军 申请人:郑州安图绿科生物工程有限公司