专利名称：一种检测或辅助检测结核性胸膜炎的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测或辅助检测结核性胸膜炎的试剂盒。
背景技术：
结核病是一种严重危害人民健康和国民经济的传染病，全球近三分之一人口感染结核分枝杆菌，而在结核病高发区结核性胸膜炎是导致胸腔积液的一个重要病因。结核性胸膜炎最可靠的诊断方法是确定结核分枝杆菌的存在或通过组织切片确定胸膜组织肉芽肿的存在。但通常胸水中结核分枝杆菌的数量很少，利用抗酸染色法检出的灵敏度极低，而组织切片又是侵入性的诊断方法，临床操作存在局限性。因此，一些利用生物学分子标志物的诊断方法也相继出现，比如腺式脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)和IFN-Y ,其含量一般认为在结核性胸膜炎胸水中升高，对于疾病的辅助诊断有一定价值，但是其疾病特异性不够理想，因为在其他一些疾病中这两种因子也升高。同时，研究也表明由于IFN-Y背景较高影响了胸水细胞的结核分枝杆菌特异性IFN-Y释放实验(IGRA)的准确性，而且在一些病人中胸水细胞取得的数量比较少，不能满足试验要求。另外，结核性胸膜炎胸部积水常常被误诊为癌性积水，因此，针对结核性胸膜炎新的简便易行的诊断方法亟待被研发出来。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测结核性胸膜炎的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括用于检测免疫因子表达量的试剂盒和装置；所述疾病特异性免疫因子为如下I)或2):I)为如下全部9种白介素-6 (IL-6)、白介素-13 (IL-13)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、嗜酸粒细胞趋化蛋白I (CCLl)、淋巴细胞趋化因子21 (CCL21)、干扰素诱导蛋白-10 (IP-10 (CXCLlO))、单核细胞趋化蛋白2 (CCL8 (MCP-2))、血浆炎性趋化因子(CXCL9 (MIG))和基质细胞衍生因子-I (CXCL12 (SDF-I))；2)为如下9种中的至少一种白介素_6、白介素-13、粒细胞集落刺激因子、嗜酸粒细胞趋化蛋白I、淋巴细胞趋化因子21、干扰素诱导蛋白-10、单核细胞趋化蛋白2、血浆炎性趋化因子和基质细胞衍生因子-I。检测上述免疫因子表达量的试剂盒为Human Cytokine/Chemokine Panel I试剂盒、Human Cytokine/Chemokine Panel II试剂盒和Human Cytokine/Chemokine Panel III试剂盒； 上述检测免疫因子表达量的装置为多功能液相芯片分析仪。上述9种免疫因子均为人源免疫因子。上述的试剂盒在制备检测或辅助检测结核性胸膜炎的产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，该检测或辅助检测的样本为离体胸水。
上述应用中，所述检测或辅助检测待测样本是否为结核性胸膜炎为用上述的试剂盒检测待测样本的离体胸水中的IL-6、IL-13、G-CSF, CCLU CCL21、IP-10 (CXCLlO),CCL8 (MCP-2), CXCL9 (MIG)和CXCL12 (SDF-I)的表达量，以确证的肺癌患者离体胸水为对照，若待测样本的离体胸水中9种免疫因子的表达量均高于或者至少ー种高于所述确证的肺癌患者离体胸水对照，则待测样本为或候选为结核性胸膜炎；反之，则待测样本不为或候选不为结核性胸膜炎。本发明的实验证明，本发明开发出ー种以待测患者的离体胸水为检测对象，利用ー组免疫学分子标识，通过多因子微球检测技术，特异性地鉴别出结核性胸膜炎的方法，通过此技术获得的多个免疫标识具有以下几个优点所需检测样本少(25ul即可一次检测多因子)、特异性高、敏感度高(可检测阈值低至3. 2pg/ml)、操作简便、可以通过多因子组合方式判断病情等。
图I为多因子表达水平比较图2为经过抗原刺激后细胞分泌上清中抗原特异性免疫因子表达水平的比较
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、试剂盒在检测或辅助检测结核性胸膜炎中的应用本发明以离体胸水为检测对象，利用ー组免疫学分子标识，通过多因子微球检测技术，特异性地鉴别出结核性胸膜炎的方法。I、检测免疫因子表达量的试剂盒和装置检测免疫分子的表达水平检测或辅助检测结核性胸膜炎的试剂盒包括检测免疫因子表达量的试剂盒和装置，检测上述免疫因子表达量的试剂盒为Human Cytokine/Chemokine Panel I试剂盒、Human Cytokine/Chemokine Pane II i式齐[J盒和 Human Cytokine/Chemokine Panel III 试剂盒；上述检测免疫因子表达量的装置为多功能液相芯片分析仪。样品收集临床上确诊的(η = 27)结核性胸膜炎患者离体胸水(TPF)，以(η = 27)结核性胸膜炎患者离体血浆(TP)、(η = 12)肺結核初发病人离体血浆(无胸膜炎，已经经过临床诊断，TB)以及(η = 15)肺癌患者离体胸水(已经经过临床诊断，CPF)为对照检测。η为样本的数量。检测的9种免疫分子如下1レ6(人白介素-6)、1レ13(人白介素-13)、6-05 (粒细胞集落刺激因子)、CCLl (嗜酸粒细胞趋化蛋白I)、CCL21(淋巴细胞趋化因子21)、IP-10 (CXCLlO)(干扰素诱导蛋白-10)、CCL8 (MCP-2)(单核细胞趋化蛋白2)、CXCL9 (MIG)(血浆炎性趋化因子)、CXCL12 (SDF-I)(基质细胞衍生因子-I)。检测上述9种免疫分子表达量所使用试剂盒(敏感度高，低至3.2pg/ml):美国Millipore 公司 Human Cytokine/Chemokine Panel I、II、III(Cat. No. MPXHCYT0-60K、MPXHCYP2-62K、MPXHCYP3-63K)。
其中G-CSF、IL-6、IL-13、IP-10 (CXCLlO)用 Human Cytokine/ChemokinePanelI (MPXHCYT0-60K)检测；CCL21(CCL21/6Ckine)、CCLl(CCL1/I309)、CCL8(MCP-2)、CXCL12(SDF-I)用 HumanCytokine/Chemokine Panel II (MPXHCYP2-62K)检测；CXCL9/MIG (CXCL9 (Μ IG))用 Human Cytokine/Chemokine Pane IIII(MPXHCYP3-63K)检测。所使用仪器和软件(仪器名称是Luminex-200，软件名称是Luminex xP0NENT3. Isoftware):多功能液相芯片分析仪 Luminex-200 (Luminex Corporation, USA)；Luminex χΡΟΝΕΝΤ 3. Isoftware (Luminex Corporation, USA)。按照试剂盒的说明书和上述仪器分别检测上述样品(均取25ul即可)中9种免疫分子的表达量，统计学检验方法运用SPSS软件，首先通过one-way analysis ofvariance (ANOVA)方法进行方差齐性分析，当方差齐时后续通过Tukey HSD或LSD方法检验组间差异性，当方差不齐时Tambane或DunnettT3方法检验组间差异性。当p < O. 05时，说明两组间存在显著性差异。(*P < O. 05 ；**p < O. 005 ；***p < O. 0005)；结果如图I、表2和表3所示，TB :肺结核初发病人离体血浆，TP :结核性胸膜炎患者离体血浆，TPF:结核性胸膜炎患者离体胸水，CPF:肺癌患者离体胸水，纵坐标为各因子的表达量；表2为TB、TP、TPF、CPF表达量平均值(单位pg/ml)
TBTPTPFCPF
IL-658.31 53. 14 60048.70 18226.04
IL-131.45 4.28 41.63 13.28
G-CSF9.42 13.79 267.29 68.22
CCLl3.05 3.92 63.76 5.19
CCL21191.96 188.26 3878.91 790.21
IP-10 (CXCLlO) 2642.36 3264. 07 24893.96 2267.16 CCL8 (MCP-2) 26.54 30. 12 1090.80 83.48 CXCL9 (MIG) 4064. 36 5192. 27 57717. 57 4667.42
CXCL12 (SDF-I) 2884.58 3117. 20 11767. 09 4699.12表3 为 TB、TP、TPF、CPF 最低值(min)和最高值(max)TBTPTPFCPF
IL-6min 4.885744 1.908569 1271.473 1575.334
max 426.8048 232.8232 199838.7 79692.23 IL-13min 1.430298 1.430298 1.994356 0.9893296
max 1.687857 20.38994 90.08186 35.10225 G-CSFmin 1.829041 9.153311 1.829041 1.829041
max 39.6813 20.42487 699.2226 213.9518 CCLlmin 0.2103856 0.7800636 1.829041 1.78375
max 9.516727 10.15748 699.2226 23.06967 CCL21min19.5 0.7800636 6.315319 21.62217
max 387.1454 10.15748 143.1675 2263.908 IP-10(CXCLlO) min 295.3258 877.8007 10000 956.7337
max 9271.346 7085.62 66826.13 5151.034 CCL8 (MCP-2) min 4.819355 4.882813 259.8504 18.48032 max 38.87123 42.98889 3815.444 448.1277 CXCL9 (MIG)min 994.6805 517.4866 50000 999.1582
max 9894.631 15210.34 91176.38 9763.798 CXCL12 (SDF-I) min 1762.057 1324.53 4220.98 1303.208
max 6770.598 6846.027 23313.39 10631.9可以看出，这组免疫分子(9种)在结核性胸膜炎胸水中均为高表达，且均显著性高于CPF (肺癌患者离体胸水)，与其他对照组均也有显著性差异，提示可以作为预示结核性胸膜炎的诊断标识。2、特异性抗原刺激后胸水中免疫分子的表达水平I)结核分枝杆菌裂解物的制备A、复苏 H37Rv冻存的H37Rv (结核分枝杆菌实验株，ATCC，25618)解冻后在7H9培养基(BD公司，Difco Middlebrook 7H9Broth, Lot. 0305232)孵育，培养液 0D580 值为 O. 6 时离心收集细菌H37Rv菌体，_80°C保存备用。B、灭活 H37Rv 菌体H37Rv菌体经65°C，30分钟灭活，离心弃上清后灭活的H37RV菌体_80°C保存备用。C、H37RV菌体超声裂解将上述灭活的H37RV菌体(IXlO8CFU)用5ml的I X PBS (磷酸ニ氢钾(KH2PO4)
O.27g，磷酸氢ニ钠(Na2HPO4) :1.4 ,氯化钠(NaCl) :8g，氯化钾(KCl) O. 2g，溶解于IL双蒸水，PH值7. 4)稀释后，重悬并分装至I. 5mL离心管内，置于冰上待用。超声破碎仪探头用次氯酸钠和酒精消毒后，按照如下程序设定(表4)进行菌体超声(超声时间12min)，得到 裂解液，用于后续抗原刺激实验。表4为超声破碎仪裂解菌体的程序设定变幅杆Φ 3
温度4°C超声时间 12min
超声开2s
输出功率 20%超声关2sD、蛋白含量测定Bradford法测定上述裂解液中蛋白浓度(300 μ g/mL)，分装后_80°C保存备用。
2)特异性抗原刺激后胸水A、准备细胞结核性胸膜炎患者离体胸水样本离心(1，500rpm, 5min)后获取胸水细胞，台盼蓝法细胞计数并观察细胞状态，用含10% (质量百分含量)胎牛血清的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度5 X IO6细胞/mL。B、抗原刺激细胞用结核分枝杆菌特异性抗原刺激后收取上清进行多因子检测。实验步骤准备96孔U型细胞培养板，每孔加入5X IO5上述A得到的胸水细胞，加入由I)的C得到的H37Rv抗原裂解液(最终使用浓度是10 μ g/mL)进行刺激，细胞吹打混匀。37°C 5%CO2培养箱内孵育72小时后，收集细胞培养上清(抗原刺激后)并分装于_80°C保存，用于后续免疫因子检测。同时，以不加入任何刺激物的细胞为对照，方法同上，72小时后收集培养上清(不刺激)待用。H37Rv裂解液刺激细胞后上清因子表达水平可反映抗原/疾病特异性。。3)检测免疫分子的表达水平用上述I中的试剂盒和仪器检测培养上清(刺激后)、培养上清(不刺激)中9种免疫因子的表达量，按照上述I的统计方法统计，结果如图2、表5和表6所示，其中，no sti为不加入结核分枝杆菌裂解物刺激，H37Rv为加入结核分枝杆菌裂解物刺激，纵坐标为各因子的表达量；表5为上清中各因子表达量的平均值
no sti H37Rv
IL-62.29 12.26
IL-131.43 28.52
G-CSF1.79 3.69
CCLl10.40 129.05
CCL21159.51 217.40CCL8 (MCP-2)23.25 39.43
IP-10(CXCLlO) 124.52 531.69 CXCL12 (SDF-I) 332.55 271.93 CXCL9 (MIG) 1402.08 7194.06表6为上清中各因子表达量的最大值(max)和最小值(min)
权利要求
1.一种检测或辅助检测结核性胸膜炎的试剂盒，包括用于检测免疫因子表达量的试剂盒和装置； 所述免疫因子为如下I)或2): 1)为如下全部9种白介素-6、白介素-13、粒细胞集落刺激因子、嗜酸粒细胞趋化蛋白I、淋巴细胞趋化因子21、干扰素诱导蛋白-10、单核细胞趋化蛋白2、血浆炎性趋化因子和基质细胞衍生因子I ; 2)为如下9种中的至少I种白介素-6、白介素-13、粒细胞集落刺激因子、嗜酸粒细胞趋化蛋白I、淋巴细胞趋化因子21、干扰素诱导蛋白-10、单核细胞趋化蛋白2、血浆炎性趋化因子和基质细胞衍生因子I。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于 所述检测免疫因子表达量的试剂盒为Human Cytokine/Chemokine Panel I试剂盒、Human Cytokine/Cnemokine Panel II 1式剂盒和 Human Cytokine/Chemokine PanelIII 试剂盒； 所述检测免疫因子表达量的装置为多功能液相芯片分析仪。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于 所述9种免疫因子均为人源免疫因子。
4.权利要求1-3中任一所述的试剂盒在制备检测或辅助检测结核性胸膜炎的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述检测或辅助检测的样本为离体胸水。
全文摘要
本发明公开了一种检测或辅助检测结核性胸膜炎的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括用于检测免疫因子表达量的装置；所述免疫因子为如下1)或2)1)为如下全部9种IL-6、IL-13、G-CSF、CCL1、CCL21、IP-10(CXCL10)、CCL8(MCP-2)、CXCL9(MIG)和CXCL12(SDF-1)。2)为如下9种中的至少一种IL-6、IL-13、G-CSF、CCL1、CCL21、IP-10(CXCL10)、CCL8(MCP-2)、CXCL9(MIG)和CXCL12(SDF-1)。本发明的实验证明，本发明开发出一种以胸水为检测对象，利用一组免疫学分子标识，通过多因子微球检测技术，特异性地鉴别出结核性胸膜炎的方法，可以通过多因子组合方式提高疾病诊断的准确率及科学判断病情等。
文档编号G01N33/68GK102621331SQ201210098089
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者于杨, 刘海鹰, 张艳, 金奇 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所