专利名称：NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫分析试剂盒的制备方法,特别是涉及一种NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法。
背景技术：
心力衰竭是各种心血管疾病的终末阶段，具有较高的死亡率，相当于一些恶性肿瘤，研究显示心力衰竭的死亡率为43%，5年死亡率达90%，重度心力衰竭的死亡率更高。脑利钠肽(BNP)由于心室受到牵拉刺激或者张力升高而分泌，能够早期反映整体甚至局部心脏结构改变导致的功能变化。BNP来自心室肌细胞，最初合成的为前脑利钠肽原 (pre-proBNP)，是由134个氨基酸组成的多肽链。pre-proBNP在心肌细胞中裂解为脑利钠肽原(proBNP，108个氨基酸)和信号肽(26个氨基酸)。proBNP进入血液后裂解为具有生理活性的BNP和氨基端-脑利钠肽原(NT-proBNP)，理论上两者是I : I的关系。BNP是血管活性物质，NT-proBNP不具备生理功能。BNP经利钠肽受体、中性内肽酶(NEP)和其他未知机制清除，NT-proBNP清除机制尚不明了。相对于BNP，NT-proBNP具有更长的血浆半衰期(60-120分钟)，BNP的血浆半衰期只有20分钟。ΝΤ-ρι·οΒΝΡ在血液中的分泌和存在具有累积作用，实际存在比BNP的浓度更高，更容易被检测到，即检测的敏感性提高，NT-proBNP更容易反映早期或者轻微心脏功能的变化。NT-proBNP具有更低的个体差异，不受个体生理性节律的影响。体外存放稳定性好， 室温下可达3天，对标本运送、保存等非常重要。不受标本采集条件(卧、坐、运动后)限制， 无论使用血清还是不同抗凝(肝素、EDTA)的血浆对测定结果都没有影响。另外，ΝΤ-ρι·οΒΝΡ 与外源性BNP不存在交叉活性，使用BNP治疗时仍可用NT-proBNP监测治疗的效果。NT-proBNP与临床心衰的严重程度成比例，心衰越严重，NT-proBNP就越高；而且 NT-proBNP能够区分轻度心衰和心功能正常者。鉴于NT-proBNP优于BNP对心力衰竭的诊断特点，2000年左右，国际上已经认定是NT-proBNP测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。通过非创伤影像技术(如超声心动图，胸部X线)只能对已发病患者进行心衰的诊断，不能对早期心衰进行预防和控制。而通过ΝΤ-ρι·οΒΝΡ的检测可以达到早期诊断的目的。目前国内外已有商品化的NT-proBNP试剂盒，如美国罗氏生产的NT-proBNP免疫检测试剂盒通过了美国FDA得认证，用于对充血性心衰的辅助诊断，使用了电化学发光的方法，灵敏度和精密度，准确度都很好，但是试剂价格昂贵。国外另有一些公司生产的 NT-proBNP试剂盒利用酶联免疫技术开发。国内一些公司的N端脑钠肽原检测试剂采用了胶体金的技术等，存在诸多缺点，如酶联免疫试剂不稳定，分辨率低，胶体金为定性检测或半定量检测等等。随着医学诊断技术向微量，高灵敏度，高特异性方向发展，酶联免疫，胶体金等技术已经出现不适应倾向。目前利用时间分辨技术开发的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ试剂盒尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种成本相对较低的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法。本发明的技术方案概述如下NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，包括如下步骤I)配制NT-proBNP校准品用小牛血清将NT-proBNP抗原纯品稀释成系列浓度， 每瓶装I个浓度点，所述NT-proBNP抗原纯品的纯度彡80% ； 2)制备NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板；3)制备铕元素标记的另一种ΝΤ-ρι ΒΝΡ单克隆抗体；4)配制洗涤液取I. 212g三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入氯化钠9g，加入吐温200. ImL,完全溶解；5)配制增强液取IOOOmL双蒸水，加入3. 6mL冰醋酸，0.5g醋酸钠，0.002 0. OlgP-萘甲酰三氟丙酮，0.01 0.05g三辛基氧化膦，I 2mL Triton X-100，混匀；6)配制分析缓冲液取6. 06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解。优选的是NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板是用下述方法制成将NT-proBNP 单克隆抗体溶解于包被稀释液中，使其浓度为5ug/mL，加入微孔板中，使200 μ I/孔，37°C 放置24小时，用包被稀释液250微升/孔洗板I次，再用质量百分浓度为2%牛血清白蛋白溶液封闭4小时，倒掉溶液，室温干燥，所述包被稀释液是用下述方法制成取6. 06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解，所述2 %牛血清白蛋白溶液的溶剂为所述包被稀释液。优选的是所述铕元素标记的另一种ΝΤ-ρι·οΒΝΡ单克隆抗体是用下述方法制成将 50 100 μ g另一种NT-proBNP单克隆抗体溶于50 μ I 0. OlM pH = 8. 5的碳酸盐缓冲液中， 加入使用100 μ I双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在4°C反应12-18小时，将反应液转移到预先用0. 05M pH = 7. 8 Tris-HCl缓冲液平衡的S^hadex G50柱上层析分离，以0.05M pH= 7. 8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个峰，得到铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体。用本发明的方法制备的试剂盒能定量检测人血清中ΝΤ-ρι·οΒΝΡ的含量，具有高灵敏，高特异，高通量，准确度高，性能稳定等特点。
图I为实施例9所制备的试剂盒中的校准品线形图(双对数标准曲线)。
具体实施例方式下面的实施例可以使本领域的技术人员更全面的理解本发明，但并不以任何方式限制本发明。本发明使用时间分辨荧光免疫分析法，其基本原理是用三价镧系稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物质；当免疫反应发生后，根据镧系稀土离子螯合物的荧光光谱的特点(特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长)，用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。铕是镧系稀土元素中的一种，异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠是三价镧系稀土离子螯合物。下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例I NT-proBNP校准品的制备用小牛血清将ΝΤ-ρι·οΒΝΡ抗原(纯度> 80% )稀释成系列浓度，浓度分别是0pg/ mL, 50pg/mL, 100pg/mL, 500pg/mL, lOOOpg/mL, 5000pg/mL ;共 6 瓶，每瓶装 0. 5mL,备用。实施例2 NT-proBNP单克隆抗体包被微孔板的制备方法配制包被稀释液取6. 06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用0. IM盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解，备用。将ΝΤ-ρι·οΒΝΡ单克隆抗体溶解于包被稀释液中，使其浓度为5ug/mL，加入微孔板中，使20(^1/孔，371放置24小时，用包被稀释液250微升/孔洗板I次，再用质量百分浓度为2 %牛血清白蛋白溶液封闭4小时，倒掉溶液，室温干燥。2 %牛血清白蛋白溶液的溶剂为所述包被稀释液。实施例3铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体的制备方法将80 μ g另一种NT-proBNP单克隆抗体溶于50 μ I 0. OlM pH = 8. 5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100 μ I双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在 4°C反应14小时，将反应液转移到预先用0. 05M pH = 7. 8 Tris-HCl缓冲液平衡的S印hadex G50柱上层析分离，以0.05M pH = 7. 8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个大峰，得到铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体，加入防腐剂备用。实施例4铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体的制备方法将50 μ g另一种NT-proBNP单克隆抗体溶于50 μ I 0. OlM pH = 8. 5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100 μ I双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在 4°C反应12小时，将反应液转移到预先用0. 05M pH = 7. 8 Tris-HCl缓冲液平衡的S印hadex G50柱上层析分离，以0.05M pH = 7. 8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个大峰，得到铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体，加入防腐剂备用。实施例5铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体的制备方法将100 μ g另一种NT-proBNP单克隆抗体溶于50 μ I 0. OlM pH = 8. 5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100 μ I双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在 4°C反应18小时，将反应液转移到预先用0. 05M pH = 7. 8 Tris-HCl缓冲液平衡的S印hadex G50柱上层析分离，以0.05M pH= 7. 8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个大峰，得到铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体，加入防腐剂备用。实施例6 NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒，由下述成分组成I) NT-proBNP校准品，制备方法同实施例I ;2) NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板，制备方法同实施例2 ；3)铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体，制备方法同实施例3 ；
4)洗涤液，用下述方法制成取I. 212g三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入氯化钠9g，加入Tween200. ImL,
完全溶解；5)增强液，用下述方法制成取IOOOmL双蒸水，加入3. 6mL冰醋酸，O. 5g醋酸钠， O. OO5g0-萘甲酰三氟丙酮，O. 03g三辛基氧化膦，ImL Triton X-100，混勻；6)分析缓冲液，用下述方法制成取6. 06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解。实施例7 NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，包括如下步骤I)配制NT-proBNP校准品，同实施例I ;2)制备NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板，同实施例2 ；3)制备铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体同实施例4 ；4)洗涤液的制备方法取1.212g三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入氯化钠9g，加入Tween200. ImL,完全溶解；5)增强液的制备方法取IOOOmL双蒸水，加入3. 6mL冰醋酸，0. 5g醋酸钠，
0.002gi3-萘甲酰三氟丙酮，O.Olg三辛基氧化膦，2mL Triton X-100，混匀；6)分析缓冲液的制备方法取6. 06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中， 用盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解。实施例8NT_proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，包括如下步骤I)配制NT-proBNP校准品，同实施例I ;2)制备NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板，同实施例2 ；3)制备铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体同实施例5 ；4)洗涤液的制备方法取1.212g三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入氯化钠9g，加入Tween200. ImL,完全溶解；5)增强液的制备方法取IOOOmL双蒸水，加入3. 6mL冰醋酸，0. 5g醋酸钠，
0.002gi3-萘甲酰三氟丙酮，0.05g三辛基氧化膦，2mL Triton X-100，混匀；6)分析缓冲液的制备方法取6. 06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中， 用盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解。实施例9本发明ΝΤ-ρι·οΒΝΡ时间分辨荧光免疫分析试剂盒的使用方法I、样本要求每次检测至少需要120微升人血清样本。用静脉穿刺法采集静脉血，让其凝结， 用离心法分离出血清。样品在+2°C到+8°C可以保存2天，如果需要长期保存，请将其置于_20°C，避免反复冻融。含有EDTA或柠檬酸盐的血清不能用来检测，因为它们对Eu元素具有螯合作用；含有肝素的血清对检测结果不产生影响；严重溶血的血清对测定结果有影响。2、检测方法2. I试剂的准备铕元素标记的另一种ΝΤ-ρι·οΒΝΡ单克隆抗体(标记物)的稀释
须在使用前半小时配制。每条反应孔需将15ul标记物和I. 5mL的分析缓冲液混匀(按照分析缓冲液标记物=100 I稀释)，备用。稀释后的标记物应在I小时内使用
并一次用完。2. 2从密封袋中取出ΝΤ-ρι·οΒΝΡ单克隆抗体包被的微孔板，取下所需数量的微孔条，将其固定于支架上，余下的微孔条放入密封袋中。2. 3加样步骤如下(I)每孔加100 μ I的NT-proBNP校准品或样品，室温振荡孵育I小时。(2)用洗涤液300 μ L/孔冲洗4次，轻轻拍干。(3)加入100 μ I以分析缓冲液稀释的标记物，室温振荡孵育I小时。(4)用洗涤液300 μ L/孔冲洗6次，轻轻拍干。(5)每孔加增强液200μ1。(加入增强液之前，吸头应使用增强液洗两次，加入过程中应避免碰到小孔边缘或其底部，以免产生污染)。(6)室温振荡孵育5分钟后，用时间分辨荧光仪测量，测量前保证每个样品板条平稳地放到测量架中。2. 4以校准品浓度的Log值为横坐标，时间分辨荧光仪读数的Log值为纵坐标绘制标准曲线，以待测血清的读数在标准曲线上查出该血清中ΝΤ-ρι·οΒΝΡ的浓度。见图I。实施例10本发明试剂盒的方法学鉴定I、灵敏度试剂盒的灵敏度不高于10pg/mL。2、特异性与其它相关物质无明显交叉反应。3、测量范围试剂盒的测量范围0_5000pg/mL。4、线性相关系数在试剂盒的测量范围内，剂量-反应曲线线性相关系数(r)应不低于O. 99。5、测定准确性以NT-proBNP标准品为对照品，试剂盒校准品的实测效价与标定效价的比值应该在0.90 I. 10之间。6、测量精密度试剂盒的批内不精密度(CV% )应不超过10. 0% ;批间不精密度(CV% )应不超过 15. 0%。7、质控品测定值质控品测定值应在允许范围内。8、稳定性将本发明试剂盒放置37°C ±0. 5°C 7天后检测上述I 7各项，结果应符合各项目规定的要求。
权利要求
1.NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)配制NT-proBNP校准品用小牛血清将NT-proBNP抗原纯品稀释成系列浓度，每瓶装I个浓度点，所述NT-proBNP抗原纯品的纯度彡80% ；2)制备NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板；3)制备铕元素标记的另一种ΝΤ-ρι·οΒΝΡ单克隆抗体；4)配制洗涤液取1.212g三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH 值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入氯化钠9g，加入吐温200. lmL，完全溶解；5)配制增强液取IOOOmL双蒸水，加入3.6mL冰醋酸，0. 5g醋酸钠，0. 002 0. OlgP-萘甲酰三氟丙酮，0.01 0.05g三辛基氧化膦，I 2mL Triton X-100，混匀；6)配制分析缓冲液取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节 PH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解。
2.根据权利要求书I所述的制备方法，其特征在于所述ΝΤ-ρι·οΒΝΡ单克隆抗体包被的微孔板是用下述方法制成将NT-proBNP单克隆抗体溶解于包被稀释液中，使其浓度为 5ug/mL,加入微孔板中，使200 μ I/孔，37°C放置24小时，用包被稀释液250微升/孔洗板I 次，再用质量百分浓度为2%牛血清白蛋白溶液封闭4小时，倒掉溶液，室温干燥，所述包被稀释液是用下述方法制成取6. 06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节 pH值为7. 8，加去离子水至IOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解，所述2%牛血清白蛋白溶液的溶剂为所述包被稀释液。
3.根据权利要求书I所述的制备方法，其特征在于所述铕元素标记的另一种 NT-proBNP单克隆抗体是用下述方法制成将50 100 μ g另一种NT-proBNP单克隆抗体溶于50 μ I 0. OlMpH = 8. 5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100 μ I双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在4°C反应12-18小时，将反应液转移到预先用0. 05M pH =7. 8Tris-HCl 缓冲液平衡的 Sephadex 650 柱上层析分离，以 0. 05M pH = 7. 8 Tris-HCl 平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个峰，得到铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，包括如下步骤1)配制NT-proBNP校准品用小牛血清将NT-proBNP抗原纯品稀释成系列浓度，每瓶装1个浓度点，所述NT-proBNP抗原纯品的纯度≥80％；2)制备NT-proBNP单克隆抗体包被的微孔板；3)制备铕元素标记的另一种NT-proBNP单克隆抗体；4)配制洗涤液；5)配制增强液；6)配制分析缓冲液。用本发明的方法制备的试剂盒能定量检测人血清中NT-proBNP的含量，具有高灵敏，高特异，高通量，准确度高，性能稳定等特点。
文档编号G01N33/68GK102608335SQ20121011692
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者董全文 申请人:协和生物制药(天津)有限公司