专利名称：高灵敏度的免疫色谱方法以及免疫色谱用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用了标记抗体的免疫色谱方法以及免疫色谱用试剂盒。
背景技术：
作为测定被检液中的特定成分的方法，存在许多利用了抗原抗体反应的免疫测定方法。在免疫测定方法中，抗体或抗原与待测定的特定成分的非特异性反应常常是个问题。因此，通常采用使用封闭剂来抑制非特异性反应的方法。作为使用了封闭剂的非特异反应抑制法，例如在ELISA的情况下将反应容器使用封闭剂进行处理，在胶乳凝聚法的情况下将胶乳粒子使用封闭剂进行处理(专利文献I)。作为封闭剂，使用牛血清白蛋白(以下简称为BSA)、酪蛋白、明胶等。另外，在专利文献2中记载了如下内容通过使用在EIA体系中在pH为7. 2的条 件下在100°C下进行了 30分钟热处理而得到的酪蛋白，能制作抑制非特异反应的载体。此夕卜，在专利文献3中公开了如下内容通过在要进行免疫测定的反应液中添加用蛋白酶分解至分子量约为1000 26000而得到的酪蛋白来抑制非特异反应。在免疫测定方法中，免疫色谱法由于操作简便、能在短时间内进行测定，因此很常用。作为免疫色谱法中使用的免疫反应，广泛使用竞争型反应或三明治型反应。其中，在免疫色谱法中三明治型反应是主流，在其典型例子中，为了检测试样中的由抗原构成的被检物质而进行如下操作。首先，通过将利用针对作为被检物质的抗原的抗体而致敏得到的微粒作为固相微粒固定于色谱载体，或者通过将该抗体本身直接固定于色谱载体，从而制备具有反应部位的色谱载体。另一方面，使标记微粒被能与被检物质特异性结合的抗体致敏来制备致敏标记微粒。使该致敏标记微粒与试样一起在色谱载体上进行色谱移动。通过以上的操作，在形成于色谱载体的反应部位上，被固定的抗体成为固定试剂，致敏标记微粒通过作为被检物质的抗原而与其特异性结合，其结果是，通过目视判断因致敏标记微粒被反应部位捕捉而产生的信号的有无或程度，即可测定试样中的被检物质的存在的有无或量。另外，在免疫色谱法中，为了抑制非特异吸附，通常在检体稀释液中添加蛋白质等封闭剂(专利文献4)。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开平6-313766号公报专利文献2 日本特开平6-194366号公报专利文献3 日本特开平2-36353号公报专利文献4 :日本特表2004-503248号公报
发明内容
发明要解决的技术问题在免疫色谱法中，为了避免因灵敏度低而检测不出作为被检物质的抗原(假阴性)的问题，有时采用使检测信号放大的方法。作为信号放大的方法，有时使用碱性磷酸酶、过氧化酶等酶作为标记，还有时通过对选自金属胶体标记以及金属硫化物标记中的标记使用含银化合物以及银离子用还原剂进行敏化(银放大)来进行检测。但是当使用了这些放大法时，有时会产生下述问题如果非特异性吸附于检测部位的标记被敏化，则虽然不存在作为被检物质的抗原但却检测出信号(假阳性)。特别是在进行信号放大的免疫色谱法中，即使是以往不会成为问题那样少的量的非特异吸附也会引发假阳性的问题。另外，在免疫色谱法中，为了抑制非特异吸附，通常在检体稀释液中添加蛋白质等封闭剂(专利文献4)，但并没有对于这种少量的非特异吸附有效的物质。另外，特别是在使用了银放大的免疫色谱法中，在使用了金属胶体标记物质和金属硫化物标记物质的免疫色谱用检测条上滴加检体并使其展开后，需要(I)使还原剂溶液展开、(2)滴加含银溶液(银放大液)。考虑到银离子的稳定性以及放大活性，银放大液通常以酸性为宜。但是，蛋白质多数会在酸性条件下析出，因此如果在银放大液中添加蛋白质，则蛋白质会析出。因此，当在检体稀释液中添加了蛋白质时，在酸性条件下蛋白质会在膜中凝聚而处处妨碍液体的流动，因此在放大后会形成斑。放大斑有时无法与检测部位的 显色区别开来，因此还会形成假阳性，是个严重的问题。本发明要解决的技术问题在于提供一种免疫色谱方法，该免疫色谱方法通过在免疫色谱方法中将信号放大时抑制假阳性的产生而能进行高灵敏度且假阳性得以降低的检测。用于解决技术问题的手段本发明人为了解决上述技术问题而进行了潜心研究，结果发现通过在酪蛋白等蛋白质的蛋白酶分解物的存在下进行免疫反应，能抑制标记的非特异吸附，从而抑制放大后的假阳性。根据本发明，可提供一种免疫色谱方法，其包含在形成了被检物质与用针对被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质的复合体的状态下，将所述复合体在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开；在不溶性载体上的检测部位捕捉被检物质和标记物质，所述不溶性载体含有针对所述被检物质的第二结合物质或对针对被检物质的第一结合物质具有结合性的物质；将捕捉到的标记物质放大来检测该被检物质。优选蛋白质的蛋白酶分解物的分子量的范围为O. IkD 15kD。优选蛋白质的蛋白酶分解物是在酸性条件下不存在作为不溶成分的析出物的分解物。 优选蛋白质的蛋白酶分解物是通过在蛋白质的蛋白酶分解物中添加酸以使pH为4以下、并除去所析出的析出物而得到的蛋白质分解物。优选蛋白质的蛋白酶分解物是酪蛋白的蛋白酶分解物。优选作为蛋白质使用的酪蛋白是选自aSl酪蛋白、aS2酪蛋白、β酪蛋白、或K酪蛋白中的I种以上的酪蛋白。优选酪蛋白的蛋白酶分解物中含有来自aSl酪蛋白的肽序列(YLGYLEQLLR、FFVAPFPEVFGK、HQGLPQEVLNNLLR)、来自a S2酪蛋白的肽序列(FALPQYLK)、来自β酪蛋白的肽序列(AVPYPQR、YPVEPFTER)、来自κ酪蛋白的肽序列(YIPIQYVLSR)中的至少I种以上。优选不溶性载体是多孔性载体。
优选含有金属的标记物质是金属胶体。优选金属胶体是金胶体。优选第一结合物质和第二结合物质中的至少任一方为抗体。优选使用包含含银化合物以及银离子用还原剂的放大液来进行将捕捉到的标记物质放大的工序。优选在形成了被检物质与用针对被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质的复合体的状态下，将所述复合体在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开后，将洗涤液在不溶性载体上展开，然后将捕捉到的标记物质放大。优选对在检测时具有平均粒子大小为I μ m以上且20 μ m以下的大小的标记物质进行检测。或者，根据本发明，可提供一种免疫色谱用试剂盒，其具备用针对被检物质的第 一结合物质修饰过的含有金属的标记物质；以及含有针对被检物质的第二结合物质或对针对被检物质的第一结合物质具有结合性的物质的不溶性载体。优选第一结合物质和第二结合物质中的至少任一方为抗体。发明的效果根据本发明，能在免疫色谱方法的银放大中抑制放大后的假阳性，能进行明确且高灵敏度的测定。
图I是示意地表示第I不溶性载体(免疫色谱用检测条)的一个方式的俯视图。图2是表示图I中所示的第I不溶性载体(免疫色谱用检测条)的一个方式的纵截面的示意图。在图I和图2中，I表示背面粘着片，2表示标记物质保持垫，3表示色谱载体(抗体固定膜)，3a表示捕捉部位，31表示检测部位，32表示对照部位，4表示吸收垫，5表示试样添加垫，10表示免疫色谱用检测条。含有被检物质的被检试样在色谱载体上展开的方向用箭头A表示。在本发明中，将箭头A的根部方向定义为上游，将箭头A的前端方向定义为下游。图3示意地表示能在本发明中使用的免疫色谱试剂盒的一个方式。51表示图I和图2中所示的第I不溶性载体(免疫色谱用检测条)，52表示液体储藏器，53表示第2不溶性载体(洗涤液添加垫)，54表示第3不溶性载体，55表示第I设备零件，56表示第2设备零件，57表示滴加孔。
具体实施例方式下面，更详细地说明本发明。本发明的免疫色谱方法中，在形成了被检物质与用针对该被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质的复合体的状态下，将所述复合体在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开。作为将上述复合体在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开的方法，只要是在流过含有被检物质的被检试样时蛋白质的蛋白酶分解物与含有被检物质的被检试样一起流动的方法即可。作为使用方式，可举出使包含含有被检物质的被检试样和蛋白质的蛋白酶分解物的溶液在不溶性载体上展开的方法等。蛋白质的蛋白酶分解物的分子量的范围优选为O. IkD 15kD，特别优选为IkD 15kD。作为蛋白质的蛋白酶分解物的分子量及其含有率的测定方法，可以通过如下方法等来测定利用本领域常用的凝胶电泳法将蛋白质按分子量进行分离，用染色液进行染色，拍摄其被染色后的条带，求出浓度的积分值。本发明中的蛋白质的蛋白酶分解物的分子量的范围是指使用上述那样的方法求出分子量和含有率、包含总蛋白质量中50%以上的分子量的范围。当使用了蛋白质的蛋白酶分解物时，由于分子量变小，即使在酸性条件下也不易析出，但产生的析出物可能会成为放大后的斑的成因。在本发明中，优选事先除去蛋白质分解物中含有的酸性条件下的不溶成分。即，作为本发明中使用的蛋白质的蛋白酶分解物，优选为在酸性条件下实质上不会析出不溶成分的分解物，更优选为在20°C的pH为4的水溶液中在lg/5ml的浓度下不会析出不溶成分的分解物。例如，可将通过在蛋白质的蛋白酶分解物中添加酸以使PH为4以下并除去析出物而得到的、除去了酸不溶物的蛋白质分解物用作蛋白质的蛋白酶分解物。关于析出物的除去，可选择倾析、超离心、过滤器过滤等方法。·关于蛋白质的种类，为了实现本发明的效果，优选使用酪蛋白、明胶、牛血清白蛋白等，可更优选使用酪蛋白。关于本发明中使用的酪蛋白的种类，优选使用选自α SI酪蛋白、aS2酪蛋白、β酪蛋白、或K酪蛋白中的I种以上的酪蛋白。作为本发明中使用的酪蛋白的蛋白酶分解物，例如可使用含有来自a SI酪蛋白的肽序列(YLGYLEQLLR、FFVAPFPEVFGK、HQGLPQEVLNNLLR)、来自 a S2 酪蛋白的肽序列(FALPQYLK)、来自β酪蛋白的肽序列(AVPYPQR、YPVEPFTER)、来自κ酪蛋白的肽序列(YIPIQYVLSR)中的至少I种的蛋白酶分解物。I.色谱通常，色谱方法是用如下所述那样的方法简便、迅速且特异性地判断和测定被检物质的方法。即将含有能与被检物质结合的第二结合物质即固定试剂(抗体、抗原等)的具有至少I个反应部位的色谱载体(不溶性载体)用作固定相。在该色谱载体上，将分散有被作为能与被检物质结合的第一结合物质的试剂修饰过的标记物质的分散液作为流动相，使其在色谱载体中进行色谱移动的同时，被检物质与标记物质特异性地结合并到达反应部位。该方法是在反应部位通过被检物质和标记物质的复合体与固定试剂特异性地结合，只有当被检试样中存在被检物质时、标记物质才会在固定试剂部位浓缩，利用这点，通过目视或使用适当的仪器对被检试样中是否存在被检物质进行定性和定量的分析。进行本发明中的色谱方法的试剂盒或装置优选内置含银化合物和银离子用还原齐U，通过以结合于固定试剂的被检物质与标记物质的复合体为核进行放大反应，可将信号放大，其结果是能实现高灵敏度。根据本发明，可进行迅速且高灵敏度的色谱。2.被检试样作为能用本发明的色谱方法进行分析的被检试样，只要是有可能含有被检物质的试样即可，没有特殊限制，例如可举出生物学试样、特别是动物(尤其是人)的体液(例如血液、血清、血浆、骨髓液、泪液、汗、尿、脓、鼻水或痰)或排泄物(例如粪便)、脏器、组织、粘膜和皮肤、认为含有它们的擦拭检体(拭子swab)、漱口液、或者动植物本身或它们的干燥体。3.被检试样的前处理在本发明的色谱方法中，可直接使用上述被检试样，或者可以以使用适当的提取用溶剂提取被检试样而得到的提取液的形式来使用、进而以使用适当的稀释剂稀释提取液而得到的稀释液的形式来使用、或以使用适当的方法将提取液浓缩后的形式来使用。作为提取用溶剂，还可使用普通的免疫学分析法中使用的溶剂(例如水、生理盐水或缓冲液等)、或者通过用溶剂进行稀释即可直接实施抗原抗体反应的水混合性有机溶剂。4.构成作为能在本发明的色谱方法中使用的色谱用检测条，例如可以如图I、图2所示那样，沿被检试样展开的方向(图I中A箭头的方向)在背面粘着片上依次配置试样添加垫、标记物质保持垫(例如金胶体抗体保持垫)、色谱载体(不溶性载体、例如抗体固定膜)以 及吸收垫。色谱载体具有捕捉部位，具有固定了与分析对象物特异性结合的抗体或抗原的区域即检测部位(有时也记为检测区域)，可以根据需要进一步具有固定了对照用抗体或抗原的区域即对照部位(有时也记为对照区域)。标记物质保持垫可如下来制备制备含有标记物质的悬浮液，将该悬浮液涂布在适当的吸收垫(例如玻璃纤维垫)后将其干燥。作为试样添加垫，本发明中可优选使用玻璃纤维垫。4-1.标记物质关于本发明中使用的标记物质，作为用于标记与被检物质(抗原)特异性结合的第一结合物质的标记，可使用含有金属的标记物质。作为能在本发明中使用的金属的种类，可优选使用贵金属金、银、钼或者铁、铅、铜、镉、铋、锑、锡或汞，可更优选使用贵金属金、银、钼。作为能在本发明中使用的含有金属的标记物质的优选方式，可使用金属胶体标记或金属硫化物标记。在本发明中，作为金属胶体标记，可优选使用钼胶体、金胶体、银胶体、铁胶体或氢氧化铝胶体等，作为金属硫化物标记，可优选使用铁、银、铅、铜、镉、铋、锑、锡或汞的各硫化物。在本发明中可更优选使用钼胶体、金胶体、银胶体。在本发明的免疫色谱法中，可将这些金属胶体标记和/或金属硫化物标记中的I种或更多种用作标记。关于金属胶体与特异结合物质的结合，可按照以往公知的方法(例如The Journal of Histochemistryand Cytochemistry, Vol. 30, No. 7, pp691-696, (1982))来进行。4-2.结合物质在本发明中，标记物质使用针对检物质的第一结合物质来修饰。关于第一结合物质，例如可使用针对被检物质(抗原)的抗体、针对被检物质(抗体)的抗原、针对被检物质(蛋白质、低分子化合物等)的适配体等对被检物质具有亲和性的化合物等。在本发明中，不溶性载体具有(a)针对被检物质的第二结合物质或(b)对第一结合物质具有结合性的物质。关于针对该被检物质的第二结合物质，例如可使用针对该被检物质(抗原)的抗体、针对该被检物质(抗体)的抗原、针对该被检物质(蛋白质、低分子化合物等)的适配体等对该被检物质具有亲和性的化合物。另外，第二结合物质和第一结合物质可以使用不同的物质，也可以使用相同的物质。关于对针对被检物质的第一结合物质具有结合性的物质，可以是被检物质本身，也可以是具有识别第一结合物质的部位的化合物，例如使被检物质的衍生物与蛋白质(例如BSA等)结合而得到的化合物等即属于此。
在本发明中，优选第一结合物质和第二结合物质中的至少任一方为抗体。在本发明的免疫色谱方法中，作为对被检物质具有特异性的抗体，可优选使用由被该被检物质免疫后的动物的血清制备的抗血清、由抗血清精制得到的免疫球蛋白级分、通过使用被其分析对象物免疫后的动物的脾脏细胞的细胞融合而得到的单克隆抗体、或者它们的片段[例如F(ab’)2、Fab、Fab’或Fv]。这些抗体的制备可通过常规方法来进行。4-3.色谱载体(抗体固定膜)作为色谱载体，可使用不溶性载体，其中优选多孔性载体。可特别优选使用硝化纤维素膜、纤维素膜、乙酸纤维素膜、聚砜膜、聚醚砜膜、尼龙膜、玻璃纤维、无纺布、布或纱等。通常使固定试剂固定在色谱载体的一部分来制作检测部位。固定试剂可以通过物理或化学的结合来直接固定于色谱载体的一部分，也可以使固定试剂与胶乳粒子等微粒发生物理或化学的结合后使该微粒被色谱载体的一部分捕获来进行固定。另外，色谱载体优选在固定试剂固定后通过利用惰性蛋白的处理等进行防非特异性吸附处理后使用。
4-4.试样添加垫试样添加垫的材质可举出纤维素滤纸、玻璃纤维、聚氨酯、聚醋酯纤维、乙酸纤维素、尼龙以及棉布等具有均匀特性的材质，但不限于这些。试样添加部不仅收纳被添加的含有被检物质的被检试样，还兼具将试样中的不溶物粒子等过滤的功能。另外，为了防止在分析时试样中的被检物质非特异性地吸附于被检试样添加部的材质而使分析的精度降低，构成试样添加部的材质有时事先进行防非特异性吸附处理后使用。4-5.标记物质保持垫作为标记物质保持垫的材料，例如可举出纤维素滤纸、玻璃纤维以及无纺布等，通过浸溃一定量的如前所述那样制备的标记物质并使其干燥来制作。4-6.吸收垫 吸收垫是在通过色谱移动而物理性地吸收被添加的试样的同时、将未能在色谱载体的检测部不溶化的未反应标记物质等吸收除去的部位，可以使用纤维素滤纸、无纺布、布、乙酸纤维素等吸水性材料。被添加的试样的色谱顶端部到达吸收部后的色谱的速度根据吸收材料的材质、大小等而各异，因此通过选择吸收材料，可设定适合于被检物质测定的速度。5.免疫检查的方法下面，关于本发明的色谱方法，对作为其具体实施方式
的三明治法进行说明。三明治法没有特殊限制，例如可按照以下的步骤来实施被检物质的分析。首先，通过先前4-2中所述的方法事先制备对被检物质(抗原)具有特异性的第I抗体和第2抗体。另外，使用4-1或4-2中所述的方法将第I抗体事先进行标记。将第2抗体固定在适当的第一不溶性载体(例如硝化纤维素膜、玻璃纤维膜、尼龙膜或纤维素膜等)上，使其与有可能含有被检物质(抗原)的被检试样(或其提取液)接触，当在该被检试样中存在被检物质时，可发生抗原抗体反应。该抗原抗体反应可与普通的抗原抗体反应同样地来进行。如果在抗原抗体反应的同时或反应后，进一步与过量的标记第I抗体接触，则当被检试样中存在被检物质时，会形成由固定第2抗体、被检物质(抗原)和标记第I抗体构成的免疫复合体。在三明治法中，通过在固定第2抗体与被检物质(抗原)与第I抗体的反应结束后除去未形成上述免疫复合体的标记第I抗体，接着对第I不溶性载体中固定了固定第2抗体的区域进行第一光学浓度测定来对标记物进行定量，即可测定被检试样中的被检物质的量。接着，通过提供金属离子和还原剂，将来自形成了上述免疫复合体的标记第I抗体的标记的信号进行放大，然后通过进行第二光学浓度测定，对放大后的标记物质进行定量，即可测定被检试样中的被检物质的量。6.洗涤在本发明中，还可以在形成了被检物质与用针对该被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质的复合体的状态下，在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开后，在不溶性载体上展开洗涤液，然后将捕捉到的标记物质进行放大。(洗涤液)用于除去未形成上述免疫复合体的标记抗体的洗涤液只要具有洗涤的功能可以是任意的洗漆液。 关于洗涤液，只要是用于洗涤特异性结合反应以外残留在色谱载体内的、S卩非特异性残留的标记物质的液体即可，没有特殊限制，可以单独仅是水或乙醇等溶剂，也可使用例如含I质量％的BSA的PBS缓冲液或表面活性剂等的溶液等。另外，作为洗涤液，还可使用后述的含有银离子的液体、含有银离子的还原剂的液体。另外，洗涤液由于在展开途中一边洗涤非特异性残留的标记物质一边展开，因此在含有标记物质的同时被展开，为了提高洗涤效果，展开前的洗涤液使用不含标记物质的液体。另外，还可使用为了提高洗涤效果而调节了其PH或者添加了表面活性剂成分或BSA等蛋白质、聚乙二醇等高分子化合物的洗涤液。(洗涤液的展开、其方向)洗涤液在检体液展开后添加到色谱用检测条中，将色谱用检测条上残留的除因抗原抗体反应而结合的之外的标记物质进行洗涤。作为洗涤液的送液方法，有如下方法在检体液展开后直接添加到试样滴加部的方法；事先在检测条上附着用于洗涤液送液的洗涤液添加垫、吸水垫，添加于该洗涤液添加垫并向吸水垫方向送液的方法；事先使检测条具备洗涤液的添加部位，在检体液展开后在该洗涤液的添加部位添加洗涤液的方法等，更优选如下方法将检体液在检测条上展开后，将用于洗涤液送液的洗涤液添加垫、吸水垫附着于检测条，向洗涤液添加垫提供洗涤液，使洗涤液展开。作为向洗涤液添加垫提供洗涤液的方法，可以在装有洗涤液的壶内插入洗涤液添加垫，也可以在洗涤液添加垫上滴加洗涤液。在本说明书中，该被检物质的液体的展开方向定义为连接试样添加垫和吸收垫的方向，洗涤液的展开方向定义为连接用于洗涤液送液的洗涤液添加垫和吸水垫的方向。当被检物质的液体的展开方向与洗涤液的展开方向所成的角度为45度到170度时，洗涤效果变好。此外，该被检物质的液体的展开方向与洗涤液的展开方向所成的角度优选为60度到170度、更优选为60度到150度。在本发明中，洗涤液添加垫(也标记为第2不溶性载体)可使用玻璃纤维垫或纤维素膜、硝化纤维素膜等。在本发明中，吸水垫(也标记为第3不溶性载体)可使用纤维素、硝化纤维素、玻璃纤维、它们的混合体等。7.放大液
放大液是所含的药剂在标记物质或被检物质的作用下通过催化性地反应而产生经着色的化合物或发光等、从而能引起信号的放大的溶液。例如可举出在金属标记上通过物理显影引起金属银的析出的银离子溶液、利用过氧化酶标记和过氧化氢的作用而形成色素的苯二胺化合物与萘酚化合物的溶液等。关于详细内容，可使用在照相化学领域的普通书籍(例如“修订照相工学的基础-银盐照相篇_，，(日本照相学会编、Corona公司)、“照相的化学”(笹井明、照相工业出版社)、“最新配方手册”(菊池真一他、7 ^ =出版社))中记载的所谓的显影液，只要是液体中含有银离子、液体中的银离子主要被还原为成为显影核的金属胶体等的所谓的物理显影液即可，没有特殊限制，均可作为放大液使用。作为放大液的具体例子，可使用包含含银化合物以及银离子用还原剂的放大液。关于本发明中的放大液的制备，可以制成同时包含含银化合物以及银离子用还原剂的I个放大液来进行使用，但作为本发明的优选方式，优选分别制成包含含银化合物的放大液和包含银离子用还原剂的放大液来进行使用。下面，对含银化合物和银离子用还原剂等进行说明。·
(含银(离子)化合物)作为含银离子化合物，可使用有机银盐、无机银盐或银络合物。优选对水等溶剂的溶解度高的含银离子化合物，可举出硝酸银、乙酸银、乳酸银、丁酸银、硫代硫酸银等。特别优选硝酸银。作为银络合物，优选配位于具有羟基或磺酸基等水溶性基团的配位基而得到的银络合物，可举出羟基硫醚银等。有机银盐、无机银盐或银络合物以银计通常含有O. OOlmol/m2 0. 2mol/m2，优选含有 0. 01mol/m2 0. 05mol/m2。(银离子用还原剂)银离子用还原剂只要能将银离子还原成银即可，可使用无机或有机的任何材料、或者其混合物。作为无机还原剂，可优选举出Fe2+、V2+、Ti3+等金属离子的化合价可变的还原性金属盐、还原性金属络合物盐。当使用无机还原剂时，需要将被氧化的离子形成络合物或还原后除去以无害化。例如，在将Fe2+用作还原剂的体系中，可使用柠檬酸或EDTA来形成氧化物即Fe3+的络合物而进行无害化。在本体系中，优选使用这种无机还原剂，更优选Fe2+的金属盐。另外，还可使用在湿式的卤化银照相感光材料中所用的显影主剂(例如甲基没食子酸盐、氢醌、取代氢醌、3-吡唑烷酮类、对氨基酚类、对苯二胺类、受阻酚类、氨肟类、吖嗪类、儿茶酚类、焦掊酚类、抗坏血酸类(或其衍生物)、及无色色素类)、以及对本领域技术人员而言熟知的其它材料、例如美国专利第6020117号中记载的材料。作为还原剂，还优选抗坏血酸还原剂。有用的抗坏血酸还原剂包含抗坏血酸和类似物、异构体及其衍生物，例如可优选举出D-或L-抗坏血酸及其糖衍生物(例如Y -乳糖型抗坏血酸、葡糖型抗坏血酸、岩藻糖型抗坏血酸、葡庚糖型抗坏血酸、麦芽糖型抗坏血酸)、抗坏血酸的钠盐、抗坏血酸的钾盐、异抗坏血酸(或L-红抗坏血酸)、其盐(例如碱金属盐、铵盐或本领域公知的盐)、烯二醇型的抗坏血酸、Enaminol型的抗坏血酸、硫代烯醇型的抗坏血酸等，特别优选D、L或D，L-抗坏血酸(或其碱金属盐)或者异抗坏血酸(或其碱金属盐)，钠盐是优选的盐。可以根据需要使用这些还原剂的混合物。8.其它助剂作为放大液的其它助剂，有时含有缓冲剂、防腐剂例如抗氧化剂或有机稳定剂、速度调节剂。作为缓冲剂，例如可采用使用了乙酸、柠檬酸、氢氧化钠或它们中任一者的盐、或者三(羟甲基)氨基甲烷的缓冲剂、其它在普通化学实验中使用的缓冲剂。适当使用这些缓冲剂，可将放大液调节至最佳的pH。另外，作为防雾剂，可使用烷基胺作为添加剂，特别优选十二烷基胺。此外，为了提高这些添加剂的溶解性，可使用表面活性剂，特别优选C9H19-C6H4-O-(CH2CH2O)50Ho9.检测时的平均粒子大小的算出方法检测时(放大后)，剪取检测带部，使用碳糊将试样背面安装于试样台后，将截面切割，进行碳蒸镀，利用扫描型电子显微镜来观察形状和大小。例如可使用日立High-Technologies制FE-STEM S-5500，通过SEM在加速电压为IOKV下利用反射电子来观 察试样表面。然后，从信号粒子中选择100个粒子，测定粒子的投影面积的当量圆直径，算出平均值，将其作为检测时的平均粒子大小。通过以下的实施例来更具体地说明本发明，但本发明不受实施例的限制。[实施例](I)检测流感A型的免疫色谱试剂盒的制作(1-1)抗流感A型抗体修饰金胶体的制作(1-1-1) F (ab’)2片段抗流感A型病毒抗体的制作使用抗流感A型病毒抗体(产品编号为7307、Medix Biochemica公司)，使用ImmunoPureIgGl Fab and F(ab，)2 Preparation Kit (产品编号为 44880、Pierce 公司)来制作。(1-1-2)抗流感A型片段抗体修饰金胶体的制作向在直径为50nm的金胶体溶液(EM. GC50、BBI公司)9mL中加入50mM的KH2PO4缓冲液(pH为7. 5) ImL进行了 pH调节而得到的金胶体溶液中，加入浓度为160 μ g/mL的(1-1-1)中制作的F(ab’)2片段抗流感A型病毒抗体溶液ImL并搅拌。静置10分钟后，力口入I质量％的聚乙二醇(PEG Mw. 20000、产品编号为168-11285、和光纯药)水溶液550 μ L并搅拌，接着加入10质量％的牛血清白蛋白(BSA FractionV、产品编号为A-7906、SIGMA)水溶液I. ImL并搅拌。将该溶液在8000X g、4°C的条件下离心(himacCF16RX、日立)30分钟后，残留ImL左右来去除上清，通过超声波洗涤机将金胶体进行再分散。之后，分散于20mL的金胶体保存液(20mM的Tris-HCl缓冲液(pH为8. 2)、0. 05质量％的PEG(Mw. 20000)、150mM的NaCl、I质量％的BSA、0. I质量％的NaN3)中，再次在8000Xg、4°C的条件下离心30分钟后，残留ImL左右来去除上清，通过超声波洗涤机将金胶体进行再分散，得到抗体修饰金胶体(50nm)溶液。(1-2)金胶体抗体保持垫(标记物质保持垫)的制作使用金胶体涂布液(20mM的Tris-HCl缓冲液(pH为8. 2)、O. 05质量％的PEG(Mw. 20000)、5质量％的蔗糖)以及水，将(1_1)中制作的流感A型抗体修饰金胶体进行稀释，稀释成520nm的光学浓度(OD)为3. O。将该溶液以每I张O. 8mL的方式均匀地涂布在剪成 8mmX 150mm 的玻璃纤维垫(Glass Fiber Conjugate PacUMillipore 公司)上，减压干燥12小时，得到金胶体抗体保持垫。(1-3)抗体固定膜(色谱载体)的制作对于剪切成25mmX 200mm的硝化纤维素膜(有塑料衬里、HiFlow Plus HF120、Millipore公司)，通过以下的方法将抗体固定来制作抗体固定膜。将膜以横向长的方式设置，在距离200mm的长边为IOmm的位置上，使用喷墨方式的涂布机(BioDot公司)以宽度为O. 7mm左右的线状来涂布制成I. 5mg/mL的抗流感A型病毒抗体(产品编号为7307、Medix Biochemica公司)溶液,作为检测部位。进而同样地在距离200mm的长边为16mm的位置(距离检测部位为6mm的位置)上，以线状来涂布制成O. 5mg/mL的对照用抗小鼠IgG抗体(抗小鼠IgG(H+L)、兔F(ab’)2、产品编号为566-70621、和光纯药)溶液，作为对照部位。涂布后的膜在热风式干燥机中于50°C下干燥30分钟。在盘中装入封闭液(含有O. 5质量％的酪蛋白(来自奶、产品编号为030-01505、和光纯药)的50mM硼酸缓冲液(pH为8. 5))500mL，在将干燥结束后的硝化纤维素膜浸溃于其中的状态下静置30分钟。然后，将膜转移并浸溃于装在同样的盘中的洗涤和稳定化液(含有O. 5质量％的蔗糖和O. 05%质量的胆酸钠的50mM Tris-HCl (pH为7. 5)缓冲液)500mL中，在该状态下静置30分钟。然后 将膜从液体中取出，在室温下干燥12小时，制得抗体固定膜。(1-4)免疫色谱用检测条的制作在背面粘着片(ARcare9020、NIPPN TechnoCluster公司)上粘贴(1-3)中制作的抗体固定膜，将25mmX200mm的膜以横向长的方式设置。以与相对于设置的膜的对照部位相当于检测部位侧的膜的长边的端部部分重叠约2_的方式，横向长地粘贴1-2中制作的金胶体抗体保持垫(标记物质保持垫)。然后，以与金胶体抗体保持垫重叠约4mm的方式，在与膜相反侧的远离的位置上横向长地重叠并粘贴试样添加垫(剪成18mmX250mm的玻璃纤维垫(GlassFiber Conjugate Pad、Millipore公司))。接着,在与金胶体抗体保持垫相反侧的抗体固定膜的端部，以与膜重叠约5_的方式横向长地重叠并粘贴吸收垫(剪成20mm X 250mm的纤维素玻璃膜(CF6、Whatman公司))。通过使用闸刀式剪切机(CM4000、NIPPN TechnoCluster公司)将这些重叠并粘贴而成的部件(免疫色谱主体部件)沿与检测部位及对照部位垂直的方向以7_的宽度与短边平行地剪切，从而如图I和图2所示意地那样来制作多张7mmX60mm的免疫色谱用检测条。将它们作为试验用免疫色谱试剂盒。(1-5)洗涤液使用在以下(1-6)中所述的放大液A-I。(1-6)银放大液的制作(1-6-1)放大液A-I (含有银离子用还原剂成分的溶液)的制作在水325g中溶解通过在水中溶解硝酸铁(III)九水合物(和光纯药、095-00995)而制得的lmol/L的硝酸铁水溶液40mL、柠檬酸(和光纯药、038-06925) 10. 5g、十二烷基胺(和光纯药、123-00246)O. lg、表面活性剂 C9H19-C6H4-O-(CH2CH2O)5(IH O. 44g。全部溶解后，一边用搅拌器搅拌一边加入硝酸(10质量％)40mL。量取该溶液80mL，加入硫酸铵铁(II)六水合物(和光纯药、091-00855) 11. 76g，将其作为放大液A-I。(1-6-2)放大液A-2 (包含含银(离子)化合物的溶液)的制作在硝酸银溶液IOmL(含有IOg的硝酸银)中加入水使总量为100g，制得放大液A-2 (10质量％的硝酸银水溶液)。(1-7)酪蛋白分解物(1-7-1)酪蛋白分解物的制作将5质量％的酪蛋白溶液(含有α SI酪蛋白、a S2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白中的I种以上)IL事先用搅拌器进行搅拌，加入纯水84. 2mL。在其中加入IOmL通过在溶解缓冲液(O. IM的磷酸钠、2mM的EDTA · 2Na、pH为7. 8)中以O. 05AU/mL的方式溶解赖氨酰肽链内切酶(R)(和光纯药、生物化学用、125-02543)而得到的液体。将其在37°C的恒温槽中静置10天，作为酪蛋白分解物使用。在酪蛋白分解物30uL中加入NuPAGE LDS样品缓冲液(4X) (LifeTechnologies公司)10uL。在70 °C下加热处理10分钟，将其注入NuPAGE Bis-Tris凝 胶(Life Technologies 公司)。使用纯水将 NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液(20X) (LifeTechnologies公司)稀释至20倍,将得到的稀释液作为电泳缓冲液,使用XCell SureLockMini-Cell (Life Technologies 公司)和电源(Life Technologies 公司)在 200V 下进行40分钟电泳。作为凝胶染色液,使用InstantBlue (Former Novexin Ltd),在室温下染色I小时，更换纯水并反复洗涤直至背景的颜色脱色为止。然后，使用LAS-4000(富士胶片株式会社)进行拍摄，通过解析软件Multi Gauge将其条带浓度进行积分，对蛋白质量的分子量及其含有率进行了定量。其结果是，总蛋白质量中50%以上为IkD以上且15kD以下的分子量范围，IkD以上且15kD以下是主要分子量范围。(1-7-2)除去了酸不溶物的酪蛋白分解物的制作对(1-7-1)中制作的酶分解酪蛋白4mL使用2mol/L的盐酸将pH调节至3. 0，进行悬浮。在4°C下静置5分钟后，在9000Xg、4°C下离心10分钟。以不破坏沉淀的方式收集上清，制得除去了酸不溶物的酪蛋白分解物。(2)评价(设备的设置)使用图3所示的免疫色谱试剂盒进行了实验。在图3的第I设备零件(55)上安装(1-4)中制作的免疫色谱用检测条(51)，在第2设备零件(56)上分别安装作为洗涤液添加垫的第2不溶性载体(53)(剪成15mmX 12mm的玻璃纤维垫(GF/F、GE Healthcare公司))以及作为吸水垫的第3不溶性载体(54)(剪成15mmX 12mm的玻璃纤维垫(GF/F、GEHealthcare 公司))。(抗原液的滴加和展开)作为被检试样(检体液)，在含有I质量％的BSA的PBS缓冲液中溶解BD FluExaman对照A+B-(Becton Dickinson公司)来制得抗原稀释溶液。利用市售免疫色谱检测试剂盒“Capilia FluA/B” (Alfresa Pharma)时的BD FluExaman对照A+B-的检测限为1/40，这里使用含有I质量％的BSA的PBS缓冲液将该阳性对照液稀释至1/3200，将其用作模拟阳性检体液1/3200。在(1_4)中制作的免疫色谱用检测条的试样添加垫上均匀地滴加检体液65 μ 1，静置2分钟。(洗涤)如上所述那样滴加检体液并静置2分钟使其展开后，在图3所示的第I设备零件
(55)的液体储藏器(52)中加入(1-6-1)中制作的含有还原剂成分的放大液(A-I) 150 μ I。使第2设备零件(56)与第I设备零件(55)相向地闭合，将第2不溶性载体(53)(洗涤液添加垫)的端部浸入液体储藏器(52)的含有还原剂成分的放大液(A-I)中，同时将第2不溶性载体(53)(洗涤液添加垫)和第3不溶性载体(54)(吸水垫)以长度方向为横向的方式安装于第I不溶性载体(51)即(1-4)中制作的免疫色谱用检测条上。如此使含有还原剂成分的放大液(A-I)在免疫色谱用检测条上展开并送液2分钟。通过该工序，免疫色谱用检测条浸入含有还原剂成分的放大液(A-I)中，并且未特异性吸附的材料被洗涤。(利用放大液的信号放大)从设于第2设备零件(56)的滴加孔(57)滴加(1_6_2)中制作的含有银离子的放大液(A-2)，将吸附于检测部位的金胶体标记放大I分钟。放大后，取出作为第I不溶性载体(51)的免疫色谱用检测条，水洗I分钟。(线的浓度测定)
使用免疫色谱用浓度测定器ICA-1000 (Hamamatsu Photonics)来测定该免疫色谱用检测条，求出背景与检测部位的吸光度之差(A0D、单位为mABS)来进行评价。(检体液)作为空白检体溶液，制作含有I质量％的BSA的PBS缓冲液，作为X 1/3200模拟阳性检体，在含有I质量％的BSA的PBS缓冲液中溶解BD FluExaman对照A+B-(BectonDickinson公司)来制作。〈比较例1>无酪蛋白将上述空白检体和模拟阳性检体直接用作检体液。<比较例2>添加酪蛋白在上述空白检体和模拟阳性检体中以最终浓度为I质量％的方式添加了酪蛋白。<实施例1>添加酪蛋白分解物在上述空白检体和模拟阳性检体中以最终浓度为I质量％的方式添加了酪蛋白分解物。〈实施例2>在上述空白检体和模拟阳性检体中以最终浓度为I质量％的方式添加了已除去酸不溶物的酪蛋白分解物。关于空白检体中的假阳性，将因斑而无法测定的情况作为对于假阳性将ImABS 50mABS的情况作为“A”、对于假阳性将51mABS IOOmABS的情况作为“B”来进行评价。另外，关于空白检体的放大面上的斑，将没有斑的情况作为“A”、将产生弱斑的情况作为“B”、将有斑的情况作为“C”来进行评价。此外，关于模拟阳性检体的线的浓度，将ImABS 50mABS的情况作为“A”、将有假阳性而无法评价的情况或因斑而无法测定的情况作为来进行评价。结果如下述表I所示。在比较例I中，产生了强的假阳性。在比较例2中，产生了放大斑，无法测定线的浓度。在实施例I中，假阳性大大降低，且模拟阳性检体1/3200中为相对于空白能显著检测出的线浓度。但产生了弱的放大斑。在实施例2中，假阳性大大降低，且模拟阳性检体1/3200中为相对于空白能显著检测出的线浓度。另外，按照“9.检测时的平均粒子大小的算出方法”来算出在上述实施例I进行检测时的检测时的平均粒子大小，结果为6 8 μ m。表I空白检体中的假阳性
权利要求
1.一种免疫色谱方法，其包含 在形成了被检物质与用针对被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质的复合体的状态下，将该复合体在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开； 在不溶性载体上的检测部位上捕捉被检物质和标记物质，所述不溶性载体含有针对被检物质的第二结合物质或对针对被检物质的第一结合物质具有结合性的物质； 将捕捉到的标记物质放大来检测被检物质。
2.根据权利要求I所述的免疫色谱方法，其中，蛋白质的蛋白酶分解物的分子量的范围为 O. IkD 15kD。
3.根据权利要求I或2所述的免疫色谱方法，其中，蛋白质的蛋白酶分解物是在酸性条件下不存在作为不溶成分的析出物的分解物。
4.根据权利要求3所述的免疫色谱方法，其中，蛋白质的蛋白酶分解物是通过在蛋白质的蛋白酶分解物中添加酸以使PH为4以下、并除去所析出的析出物而得到的蛋白质分解物。
5.根据权利要求I或2所述的免疫色谱方法，其中，蛋白质的蛋白酶分解物是酪蛋白的蛋白酶分解物。
6.根据权利要求5所述的免疫色谱方法，其中，酪蛋白是选自CiSl酪蛋白、CIS2酪蛋白、β酪蛋白或K酪蛋白中的I种以上的酪蛋白。
7.根据权利要求I或2所述的免疫色谱方法，其中，第一结合物质和第二结合物质中的至少任一方为抗体。
8.根据权利要求I或2所述的免疫色谱方法，其中，使用包含含银化合物以及银离子用还原剂的放大液来进行将捕捉到的标记物质放大的工序。
9.根据权利要求I或2所述的免疫色谱方法，其中，在形成了被检物质与用针对该被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质的复合体的状态下，将该复合体在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开后，将洗涤液在不溶性载体上展开，然后将捕捉到的标记物质放大。
10.一种免疫色谱用试剂盒，其特征在于，具备 用针对被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质；和 含有针对被检物质的第二结合物质或对针对被检物质的第一结合物质具有结合性的物质的不溶性载体。
11.根据权利要求10所述的免疫色谱用试剂盒，其中，所述第一结合物质和第二结合物质中的至少任一方为抗体。
全文摘要
本发明提供一种免疫色谱方法，该免疫色谱方法通过在将信号放大时抑制假阳性的产生而能进行高灵敏度且假阳性得以降低的检测。该免疫色谱方法包含在形成了被检物质与用针对被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质的复合体的状态下，将所述复合体在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开；在含有针对被检物质的第二结合物质或对针对被检物质的第一结合物质具有结合性的物质的不溶性载体上的检测部位上捕捉被检物质和该标记物质；将捕捉到的标记物质放大来检测被检物质。
文档编号G01N33/543GK102830226SQ20121019451
公开日2012年12月19日 申请日期2012年6月13日 优先权日2011年6月16日
发明者片田顺一, 知久浩之 申请人:富士胶片株式会社