一种综合检测he4、ca125的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物和医学检测【技术领域】，具体涉及一种在同一反应体系内同时综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125的试剂盒，同时还涉及该试剂盒的应用。该试剂盒包括：分别抗HE4、CA125第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Sm3+标记的抗HE4、Eu3+标记的抗CA125第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；荧光增强剂；洗涤液；质控品。本发明提供的试剂盒可用于卵巢癌的临床辅助诊断、疗效观察及预后判断，对卵巢癌肿瘤的治疗和预防具有重要意义，同时检测两个肿瘤标志物，简化了检测步骤，提高了检测数据综合分析的特异性和灵敏性。
【专利说明】—种综合检测HE4、CA125的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物和医学检测【技术领域】，具体涉及一种在同一反应体系内同时综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125的试剂盒，同时还涉及该试剂盒的应用。
【背景技术】
[0002]卵巢癌发病隐匿，预后差，被形容为最为致命的癌症之一。卵巢癌的早期症状很不明显，初期症状是腹部疼痛或膨胀、肠胃消化不良，不易引起足够重视，一般卵巢癌患者发现时都到了晚期，因此治愈率极低。如果能在早期发现卵巢癌就可大大提高卵巢癌的治愈率，为了达到这一目的，人们进行了大量的研究工作。
[0003]CA125是1983年由Bast等人从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体0C125结合的一种糖蛋白，存在于上皮性卵巢癌组织和病人的血清中，主要用于辅助诊断恶性浆液性卵巢癌，上皮性卵巢癌，同时也是卵巢癌术后、化疗后疗效观察的指标。CA125是一种诊断卵巢癌和监测其复发最敏感的指标之一，但CA125在患者发病早期往往检测不到，其临床应用有一定的局限性。鉴于此，国内外的专家学者都致力于寻找更为有效的标志物，以便能在早期、更加准确的确诊卵巢癌。
[0004]目前，国内外很多的专家、学者常以HE4、CA125两项指标综合确诊卵巢癌，两项指标综合分析在特异性和敏感度上明显高于单一指标。而常规实验室或医疗单位用于检测该两项指标通常采用单一试剂盒，即一个试剂盒针对一种肿瘤标记物的检测，此种方式存在的缺点是:1、检测步骤繁多，费时费力；2、两种标记物分别采用2种试剂盒检测，由于不同生产厂家的试剂盒存在差异，且同一厂家的不同试剂盒由于检测的标记物不同可能会存在控制条件、参数的差异而导致检测结果存在误差，此种误差在综合分析两种标记物的特异性和敏感性上会产生较大的影响，可能导致判断结果相差甚远。因此，开发一种能够在相对同一的检测条件下同时能够检测该两种肿瘤标记物的试剂盒，就能降低由于人为原因造成的检测误差，大大提高综合分析检测结果的特异性和敏感性，对下一步的研究或判断做出准确的结论提供更充分的依据。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供一种在同一反应体系内同时综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125的试剂盒。
[0006]本发明的目的还在于提供一种该试剂盒的应用。
[0007]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:一种试剂盒，把两种卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125综合在同一微孔的同一反应体系内，米用时间分辨突光免疫法检测,该试剂盒包括:分别抗HE4、CA125第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Sm3+标记的抗HE4、Eu3+标记的抗CA125第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；荧光增强剂；洗涤液；质控品。
[0008]其中，所述的第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的制备方法为:把分别抗HE4、CA125的第一株单克隆抗体组成的混合抗体用包被缓冲液稀释，制得抗体包被液，然后向微孔板的每个孔中分别加入50 μ I的抗体包被液，于37°C包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入100μ I的封板液，于室温封闭2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得混合抗体包被的微孔板。该微孔板密封于铝箔袋中，4°C保存备用。
[0009]所述抗体包被液中，分别抗HE4、CA125的第一株单克隆抗体的浓度均为0.014?
0.026g/L。
[0010]进一步的，所述包被缓冲液的制备方法为:取浓度为0.05mol/L、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得包被缓冲液。
[0011]所述封板液的制备方法为:向浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA,配制成BSA质量百分比浓度为1%的BSA的PBS缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得封板液。
[0012]用Sm3+标记的抗HE4、Eu3+标记的抗CA125第二株单克隆抗体混合抗体的制备方法，其中每种抗体的标记流程步骤相同，只是分别抗HE4、CA125的抗体分别对应的稀土离子螯合物标记物为N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Sm、N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Eu，下面把各自的抗体统称为标记抗体，把各自对应的标记物统称为稀土离子螯合物，具体制备方法为:
[0013](I)抗体标记前处理
[0014]用截留分子量为50kDa的离心柱对抗体进行标记前纯化处理，具体步骤如下:悬空加入Img抗体于50kDa的离心柱中，9000rpm离心8分钟，弃掉滤液；往离心柱中加入200 μ I标记缓冲液,9000rpm离心8分钟,弃掉滤液,该步骤重复四次，最后一次将离心管取出，弃掉滤液；往离心柱中加入50 μ I标记缓冲液，让其静置I分钟，然后将离心柱的滤膜反转装入离心管中，8000rpm离心6分钟,收集滤液,即得到待标记的抗体；
[0015](2)抗体标记处理
[0016]称取稀土离子螯合物0.1?0.5mg,加入50?100 μ I超纯水进行溶解；将螯合试剂加入到盛有待标记抗体的EP管中，混合均匀；置于摇床上4°C过夜，制得标记好的抗体；
[0017]用三倍柱体积的PBS缓冲液作为柱平衡液平衡SuperdeX2001X30Cm柱，用移液器吸取已标记好的抗体缓慢上样，用洗脱液进行洗脱，流速控制在lml/min，蛋白检测仪检测到蛋白峰收集样品，将收集的目的产物经过0.22微米滤膜除菌；用比活度测定方法对标记抗体进行标记率的计算与分析。长期储存标记抗体可以将高纯度的BSA加入到标记抗体溶液中，BSA的终浓度为0.1%，可置于4°C或_20°C进行保存。
[0018]所述荧光增强剂的制备方法为:将ILpH值为3.2、浓度为0.lmol/L的醋酸缓冲液与IgTriton X_100、5?10 μ mo I β -萘甲酰三氟丙酮、50?100 μ mo I三辛基氧化磷混合，摇匀，制得荧光增强剂。
[0019]所述洗涤液的制备方法为:在浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温-20，混匀，制得吐温-20质量百分比浓度为0.05%的PBS溶液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得洗涤液。
[0020]所述质控品为HE4、CA125标准品的混合物。
[0021]一种所述的试剂盒在综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125中的应用。[0022]试剂盒在综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125中的应用，具体包括以下步骤:
[0023](I)用分析缓冲液稀释质控品，制成具有系列浓度梯度包含有HE4、CA125标准品的混合溶液；
[0024](2)将待测样品与步骤(I)制备的标准品混合溶液分别加入抗HE4、CA125第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能分别与HE4、CA125结合的标记有稀土离子螯合物的第二株单克隆抗体混合抗体，之后加入荧光增强剂，进行时间分辨荧光免疫检测，得到发光值；
[0025](3)根据测定的具有系列浓度梯度的包含HE4、CA125标准品的混合溶液的发光值做标准曲线；
[0026](4)以测定的待测样品中的HE4、CA125发光值和标准品中HE4、CA125各自的标准曲线的发光值做比较，得出待测样品中HE4、CA125各自的含量。
[0027]其中，所述待测样品为人体血清。
[0028]本发明提供的试剂盒，采用时间分辨荧光免疫检测方法，实现同时综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125的目的。时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)是一种以稀土离子为标记物，根据稀土离子螯合物的发光特点，用时间分辨技术测定特异性荧光的技术方法。TRFIA利用稀土离子的激发光和发射光的波长不同，同时发射光具有长的衰减时间，这样可以有效的排除非特异性荧光的干扰，具有线性范围宽、灵敏度高和稳定性好等优点，另外，可以利用不同的稀土离子的不同的发射光波长和不同的衰减时间，实现同一反应体系内同时检测多个标志物，这样和单个指标分开检测相比可以节约时间、人员、试剂等，这些特点正好适合本发明的同时在同一反应体系内检测多指标。
[0029]本发明提供的卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125时间分辨荧光免疫检测试剂盒，具有非常好的线性范围，检测HE4的线性范围为30pmol/L?1100pmol/L，检测限为15pmol/L ；检测CA125的线性范围为8U/ml?590U/ml，检测限为4U/ml，各检测指标的正常参考值分别为:HE4为O?120pmol/L，CA125为O?35U/ml。本发明提供的卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125时间分辨荧光免疫检测试剂盒可用于卵巢癌的临床辅助诊断、疗效观察及预后判断，对卵巢癌肿瘤的治疗和预防具有重要意义。
[0030]采用本发明提供的试剂盒可实现在同一反应体系内同时综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4和CA125，检测操作简单，步骤少，所需时间短，方便快捷；检测结果准确，避免了现有的采用两种单项试剂盒分别检测两项指标HE4、CA125，再进行综合判断而引起的判断误差，大大提高了检测结果的特异性和敏感性，对下一步的研究或判断做出准确的结论提供了可靠依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为本发明实施例1提供的试剂盒同一微孔内同一反应体系反应原理不意图；
[0032]图2为本发明实施例1提供的试剂盒与CanAg公司的试剂盒测试HE4相关回归分析图(r=0.985，P < 0.05)；
[0033]图3为本发明实施例1提供的试剂盒与罗氏公司的试剂盒测试CA125相关回归分析图(r=0.986，ρ〈0.05)。【具体实施方式】
[0034]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0035]实施例1
[0036]本实施例提供的检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125的试剂盒，包括:抗HE4的抗体9F3、抗CA125的抗体M32112M单克隆抗体组成的混合抗体包被的微孔板；用Sm3+标记的IOEl抗体(抗HE4的抗体)、用Eu3+标记的M86306M抗体(抗CA125的抗体)单克隆抗体组成的混合抗体；分析缓冲液；荧光增强剂；洗涤液；HE4、CA125标准品混合组成的质控品。
[0037]所述试剂盒中:抗HE4的单克隆抗体9F3U0E1抗体为发明人自制；抗CA125的单克隆抗体M32112M、M86306M抗体购自Meridian公司。
[0038]包被缓冲液的制备方法为:取浓度为0.05mol/L、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得包被缓冲液。
[0039]封板液的制备方法为:向浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA，配制成BSA质量百分比浓度为1%的BSA的PBS缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得封板液。
[0040]9F3、M32112M混合抗体包被的微孔板的制备方法为:把混合抗体用包被缓冲液稀释，制得混合抗体包被液，混合抗体包被液中，分别抗HE4、CA125的第一株单克隆抗体的浓度均为0.014?0.026g/L，然后向微孔板的每个孔中分别加入50 μ I的混合抗体包被液，使每孔中均含有0.7?1.3μ g的9F3和M32112M抗体，即每孔中均含有0.7?1.3μ g的9F3抗体、0.7?1.3μ g的M32112M抗体，于37°C包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入100 μ I的封板液，于室温封闭2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得混合抗体包被的微孔板，密封于铝箔袋中，4°C保存备用。
[0041]Sm3+标记10E1、Eu3+标记M86306M的制备方法为:每种抗体的标记流程步骤相同，只是分别抗HE4、CA125的抗体分别对应的稀土离子螯合物标记物为N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Sm、N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Eu。
[0042]以N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Sm标记HE4的抗体IOEl为例，标记的具体制备方法和步骤为:
[0043](I)标记前应用截留分子量为50kDa的离心柱对IOEl进行标记前纯化处理,具体步骤如下:悬空加入ImglOEl抗体于50kDa的离心柱中，9000rpm离心8分钟,弃掉滤液；往离心柱中加入200 μ I标记缓冲液，9000rpm离心8分钟，弃掉滤液，该步骤重复四次，最后一次将离心管取出，弃掉滤液；往离心柱中加入50 μ I标记缓冲液，让其静置I分钟，然和将离心柱的滤膜反转装入离心管中，8000rpm离心6分钟，收集滤液，即得到待标记的抗体IOEl ；其中，标记缓冲液为50mmol/L、pH值为9.0的碳酸盐缓冲液；
[0044](2)称取稀土离子螯合物标记物N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Sm0.2mg,加入80 μ I超纯水进行溶解，制成螯合试剂；将螯合试剂加入到盛有待标记抗体IOEl的EP管中，混合均匀；置于摇床上4°C过夜，制得标记好的抗体10E1，即用Sm3+标记的IOEl抗体；
[0045]用三倍柱体积的PBS缓冲液作为柱平衡液平衡SuperdeX2001X30Cm柱，用移液器吸取用Sm3+标记的IOEl抗体缓慢上样，用洗脱液进行洗脱，流速控制在lml/min，蛋白检测仪检测到蛋白峰收集样品，将收集的目的产物经过0.22微米滤膜除菌；用比活度测定方法对标记抗体进行标记率的计算与分析。长期储存标记抗体可以将高纯度的BSA加入到标记抗体溶液中，BSA的终浓度为0.1%，可置于4°C或_20°C进行保存。
[0046]分析缓冲液的制备方法为:向每升浓度为0.05mol/L、pH值为8.0的Tris-Hcl缓冲液中加入9g NaCU0.5g NaN3UOg BSA、0.1ml吐温_40、5g聚乙二醇，混合均匀，即制得分析缓冲液。
[0047]荧光增强剂的制备方法为:将IL pH值为3.2、浓度为0.lmol/L的醋酸缓冲液与Ig Triton X_100、5?10 μ mol β -萘甲酰三氟丙酮(β _NTA)、50?100 μ mol三辛基氧化磷(TOPO)混合，摇匀，制得荧光增强剂。
[0048]洗涤液的制备方法为:在浓度为0.0lmol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温-20，混匀，制得吐温-20质量百分比浓度为0.05%的PBS溶液，然后用质量百分比浓度为
0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得洗涤液。
[0049]质控品为HE4、CA125标准品的混合物。HE4、CA125标准品均购自Abnova公司。
[0050]实施例2
[0051]本发明实施例1提供的试剂盒在综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125中的应用，即采用本发明实施例1提供的试剂盒，同时综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125时间分辨荧光免疫检测方法，其反应原理如图1所示，采用双抗体夹心法，包括以下步骤:
[0052](I)用分析缓冲液稀释HE4、CA125标准品混合物，即质控品，制成具有系列浓度梯度包含有HE4、CA125两种标准品的混合溶液；
[0053](2)分别取50 μ I待测样品人体血清和步骤(I)制备的标准品混合溶液，加入9F3、Μ32112Μ混合抗体包被的微孔板的不同孔中，37°C温育I小时，三次洗涤(洗涤时所用洗涤液的配制方法为:每升PBS缓冲液中加入9g氯化钠、0.5ml吐温_20，摇匀，即可)，之后加入50μ I混合抗体工作液(用分析缓冲液以体积比1:2000稀释混合标记抗体储存液，制得混合抗体工作液，该混合抗体工作液的组成为:其中含有30ng?60ng Sm3+标记的10E1、50ng?90ng Eu3+标记的M86306M，其余为分析缓冲液)，震荡均匀，37°C温育I小时，用洗涤液洗5次，在吸水纸上控干，加入200 μ I荧光增强剂，震荡10分钟，在时间分辨荧光仪上测量荧光强度，激发光波长为340nm ;643nm、615nm分别为Sm3+、Eu3+的最强发射光峰；分别测量各自的发光值。把不同浓度的HE4、CA125混合标准品中各指标分别和各自的发光值做标准曲线，得到不同指标的各自标准曲线，待测样品人体血清的浓度按标准曲线计算得出。得到试剂盒的精密度:HE4分析内和分析间的变异系数分别为2.1%?4.3%、3.2%?6.6% ；CA125分析内和分析间的变异系数分别为2.8%?4.8%、3.7%?7.3%。
[0054]实施例3
[0055]用本发明的试剂盒检测40份血清样本得到的HE4、CA125指标的数值和用同样的40份血清样本分别用CanAg公司的试剂盒测试HE4、罗氏公司的试剂盒测试CA125所得到的数据分别做回归相关性分析，分别对应附图2、3，从附图可以看出，本发明试剂盒测试得到的各指标数据和分别用单指标试剂盒测试得到的数据具有很好的相关性。
【权利要求】
1.一种综合检测HE4、CA125的试剂盒，把两种卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125综合在同一微孔的同一反应体系内，采用时间分辨荧光免疫法检测，其特征在于:该试剂盒包括:分别抗HE4、CA125的第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Sm3+标记的抗HE4、Eu3+标记的抗CA125的第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；荧光增强剂；洗涤液；质控品。
2.根据权利要求1所述的综合检测HE4、CA125的试剂盒，其特征在于:所述的第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的制备方法为:把分别抗HE4、CA125的第一株单克隆抗体混合抗体用包被缓冲液稀释，制得抗体包被液，然后向微孔板的每个孔中分别加入50 μ I的所述抗体包被液，于37°C包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入100 μ I的封板液，于室温封闭2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得混合抗体包被的微孔板。
3.根据权利要求2所述的综合检测ΗΕ4、CA125的试剂盒，其特征在于:所述抗体包被液中，分别抗HE4、CA125的第一株单克隆抗体的浓度均为0.014?0.026g/L。
4.根据权利要求1所述的综合检测HE4、CA125的试剂盒，其特征在于:所述荧光增强剂的制备方法为:将IL pH值为3.2、浓度为0.lmol/L的醋酸缓冲液与Ig Triton X-100、5?10 μ mo I β -萘甲酰三氟丙酮、50?100 μ mo I三辛基氧化磷混合,摇勻，制得突光增强剂。
5.根据权利要求1所述的综合检测HE4、CA125的试剂盒，其特征在于:所述洗涤液的制备方法为:在浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温_20，混匀，制得吐温-20质量百分比浓度为0.05%的PBS溶液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得洗涤液。
6.根据权利要求1所述的综合检测HE4、CA125的试剂盒，其特征在于:所述质控品为HE4、CA125标准品的混合物。
7.—种权利要求1-6任一所述的综合检测HE4、CA125的试剂盒在综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125中的应用。
8.根据权利要求7所述的试剂盒在综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125中的应用，其特征在于，包括以下步骤: (1)用分析缓冲液稀释质控品，制成具有系列浓度梯度包含有HE4、CA125标准品的混合溶液； (2)将待测样品与步骤(I)制备的标准品混合溶液分别加入抗HE4、CA125第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能分别与HE4、CA125结合的标记有稀土离子螯合物的第二株单克隆抗体混合抗体，之后加入荧光增强剂，进行时间分辨荧光免疫检测，得到发光值； (3)根据测定的具有系列浓度梯度的包含HE4、CA125标准品的混合溶液的发光值做标准曲线； (4)以测定的待测样品中的HE4、CA125发光值和标准品中HE4、CA125各自的标准曲线的发光值做比较，得出待测样品中HE4、CA125各自的含量。
9.根据权利要求8所述的试剂盒在综合检测卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125中的应用，其特征在于:所述待测样品为人体血清。
【文档编号】G01N33/577GK103575891SQ201210275663
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月3日 优先权日:2012年8月3日
【发明者】王嘎, 程自卿 申请人:河南生生医疗器械有限公司