专利名称：一种基于量子点—多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及生物分析和纳米技术领域，特别涉及一种基于量子点一多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法。
背景技术：
蛋白水解酶(protease, proteinase)是催化多肽或蛋白质水解的酶的统称,简称蛋白酶。广泛分部于动物、植物以及细菌当中，种类繁多，在动物的消化道以及体内各种细胞的溶酶体内含量尤为丰富。蛋白酶对机体的新陈代谢以及生物调控起重要作用。近年来，实验室直接或间接检测酶的方法有较大的发展，特别是直接检测酶活性更是实验医学的研究热点。血浆酶浓度的检测对临床疾病的诊断，病程发展、预后以及疗效 的监测和评估等都具有较重要的意义。酶的直接检测方法主要有发色底物法和荧光适配体法等。但发色底物法成本高、荧光适配体法底物易水解、操作复杂，故适用范围有限。最近，Medintz提出了一种基于量子点的荧光光谱法，可实现凝血酶活性的检测，为酶活性的检测提供了一种新的思路(Medintz I. L. , Clapp A. R. , Brunei F. M. , et al. Nat. Mater. 2006, 5, 581 - 588)。毛细管电泳(CE)具有高效、高速、微量、低消耗、操作模式多，分离方法开发容易等优点，由于具备如此多的优点以及分离生物大分子的能力，CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。尤其是将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管电泳的应用。本试验建立的酶活性分析检测方法，克服了已有方法存在的缺陷，可满足大批量检测需要，适用范围较广，有较高的精确性及较好的稳定性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术对酶活性检测的不足，本发明提供一种基于量子点一多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种基于量子点一多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法，首先制备一种量子点一多肽复合物，多肽用荧光标记，量子点与荧光分子之间可以产生荧光共振能量转移(FRET)。将量子点与多肽混合后，分别加入不同浓度的酶；然后进行毛细管电泳检测，同时检测量子点和荧光分子标记的多肽通道的荧光强度，将量子点和荧光分子标记的多肽荧光强度的变化换算成酶每分钟切割的多肽浓度作为Y轴，以酶浓度为X轴，曲线拟合得到酶活性检测的参数；其中多肽为含有待测酶识别位点的多肽，其中C端为组氨酸标签序列或半胱氨酸，N端是带负电的氨基酸并用染料分子标记。本发明方法中所述的毛细管电泳检测中，电泳缓冲液优选为25 mM硼酸缓冲液，PH9. 3。所述硼酸缓冲液经O. 22 μ m滤膜过滤。本发明中所述的染料分子为量子点、TAMRA、罗丹明、Texas Red、Cy3或Cy5，且满足标记生物分子的染料分子与量子点之间可以发生荧光共振能量转移。本发明方法可用于检测各种水解酶活性，根据不同的酶，多肽为含有相应酶识别位点的多肽。例如检测凝血酶时，所述的多肽为含有凝血酶切序列LVPRGS的多肽。将酶与量子点一多肽复合物混合后，可根据FRET信号的变化检测酶活性。实验证明，该方法操作简单，检测灵敏度高，所需时间短。该方法是对传统酶活性检测技术进行改进，结合多波长荧光检测灵敏度高等优点，建立的一种新的高灵敏酶活性检测技术。本发明的有益效果是，本发明提供一种基于量子点一多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法，操作容易，检测灵敏度高，可实现酶活性检测；荧光光谱仪可同时检测多个荧光波长，从而减少了误差，提高了检测的准确性。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图I是本发明所用的量子点一多肽复合物发生荧光共振能量转移示意图。图2是用量子点一多肽复合物QD H6-Cy5检测凝血酶酶活性的毛细管电泳图。不同浓度的凝血酶(a, O μΜ; b, O. 034 MM; c, O. 068 MM; d, 0. 135 μΜ; e, 0. 27 MM; f,0.54 μΜ; g, 1.35 μΜ)与QD H6_Cy5在37 °C混合10分钟后用毛细管电泳荧光检测，检测波长分别为612 nm (检测量子点)和661 nm (检测Cy5)。H6-Cy5:QD=32, [QD]=0. 5 μΜ.
图3是凝血酶酶活性检测的动力学曲线。
具体实施例方式现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。本发明一种基于量子点一多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法的操作流程如下
I.首先制备一种量子点一多肽复合物，多肽用荧光标记，量子点与荧光分子之间可以产生FRET。将量子点与多肽混合后，分别加入不同浓度的酶。2电泳缓冲液本方法中所用的电泳缓冲液为25mM硼酸缓冲液(pH9. 3)。3毛细管本方法中所用的毛细管为未涂层毛细管(内径75 μ m,长度60 cm,有效长度35 cm)ο4电泳检测进样电压12 KV，进样10 S，然后停止加压。分离电压18 KV，分离10 min,同时检测供体(量子点)和受体(荧光分子标记的多肽)通道的荧光强度，收集、分析得到相应的检测结果。5将供体和受体荧光强度的变化换算成酶每分钟切割的多肽浓度作为Y轴，以酶浓度为X轴，曲线拟合得到酶活性检测的参数。实施例I凝血酶活性检测 实例中使用的仪器及操作条件如下
所用毛细管电泳为基于荧光显微镜自搭毛细管电泳系统，高压电源为上海核物理研究所生产；荧光光谱仪为海洋光学QE65000 ;自制显微镜接口，将显微镜标准口的荧光通过光纤导入光谱仪。采用电压进样，进样电压12 KV，进样时间为10 S，电泳电压为18 KV，电泳10 min。
图I为检测凝血酶活性过程中，量子点一多肽复合物发生荧光共振能量转移示意图。图2为用量子点一多肽复合物QD H6_Cy5检测凝血酶酶活性的毛细管电泳图。设置光谱仪的检测波长分别为612 nm (检测QDs)和661nm (检测Cy5)。实验结果表明，凝血酶的浓度增加，FRET信号逐渐减弱，因此该方法可以用来检测酶活性。并且可根据不同凝血酶浓度的荧光强度变化进行曲线拟合，计算酶活性的参数(图3)。
权利要求
1.一种基于量子点一多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法，其特征在于首先制备量子点一多肽复合物，多肽用荧光标记，量子点与荧光分子之间可以产生荧光共振能量转移；将量子点与多肽混合后，分别加入不同浓度的酶；然后进行毛细管电泳检测，同时检测量子点和荧光分子标记的多肽通道的荧光强度，将量子点和荧光分子标记的多肽荧光强度的变化换算成酶每分钟切割的多肽浓度作为Y轴，以酶浓度为X轴，曲线拟合得到酶活性检测的参数；其中多肽为含有待测酶识别位点的多肽，其中C端为组氨酸标签序列或半胱氨酸，N端是带负电的氨基酸并用染料分子标记。
2.如权利要求I所述的基于量子点一多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法，其特征在于所述的毛细管电泳检测中，电泳缓冲液为25mM硼酸缓冲液，pH9. 3。
3.如权利要求2所述的基于量子点一多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法，其特征在于所述硼酸缓冲液经O. 22 μ m滤膜过滤。
4.如权利要求I所述的基于量子点一多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法，其特征在于所述的酶为凝血酶；所述的多肽为含有凝血酶切序列LVPRGS的多肽，其中C端为组氨酸标签序列或半胱氨酸，N端是带负电的氨基酸并用染料分子标记。
5.如权利要求I所述的基于量子点一多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法，其特征在于所述染料分子为量子点、TAMRA、罗丹明、Texas Red、Cy3或Cy5，且满足标记生物分子的染料分子与量子点之间可以发生突光共振能量转移。
全文摘要
本发明涉及一种基于量子点—多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法，属于生物分析、纳米技术领域。首先制备一种量子点—多肽复合物，多肽用荧光标记，量子点与荧光分子之间可以产生荧光共振能量转移(FRET)。将酶与量子点—多肽复合物混合后，可根据FRET信号的变化检测酶活性。实验证明，该方法操作简单，检测灵敏度高，所需时间短。该方法是对传统酶活性检测技术进行改进，结合多波长荧光检测灵敏度高等优点，建立的一种新的高灵敏酶活性检测技术。
文档编号G01N21/64GK102879454SQ201210367070
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者王建浩, 邱琳, 蒋鹏举, 王车礼 申请人:常州大学