专利名称：β2受体生物传感器、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种电化学生物传感器、制备方法及其应用，特别是一种β 2受体生物传感器、制备方法及其应用。
背景技术：
β 2肾上腺素能激动剂(简称β 2激动剂或β 2配体、俗称瘦肉精)是一类人工合成激素类药物，家族成员达数十种之多。其共同作用机制是:β 2激动剂首先结合于细胞膜上的β 2肾上腺素能受体(简称β 2受体)，通过G蛋白偶联的cAMP信号转导途径发挥正常生理效应，同时还具有增强肌肉，减少脂肪的生理作用，已被滥用作生长促进剂以提高家畜瘦肉率，肉类食品中的该类药物残留严重危害人民身体健康。现有检测技术无法根本遏制β 2激动剂的滥用。生物电化学传感器主要由生物分子识别和信息转换部件两部分组合构成。其设计原理是待测物通过生物分子识别部件将被感知物质的非电信号转换成可测量的电信息，再经过放大信号处理，进行信号输出。电化学体系借助电极实现电能的输入或输出，从而获得电极表面修饰物质的电信号，常用的为三电极体系。三电极体系包括工作电极、辅助电极(也称对电极)和参比电极，电流流经工作电极和对电极。电化学方法作为一种分析检测方法，具有灵敏度高、快速、简便快捷等优点。以电化学为基础发展起来的受体生物传感器技术如今受到了极大的关注。电化学受体生物传感器是将受体蛋白(或载有该受体蛋白的细胞膜)作为分子识别元件固定于金属表面从而构建工作电极，当与待测定的配体分析物发生亲合性结合时，可在三电极体系中将这种结合作用转换、放大并输出电化学信号。电化学受体生物传感器技术综合了现代生物和微电子二大技术，既具有前者受体-配体结合的高度特异性和广谱性的特点，又具有后者灵敏、快速、操作简易的特点，这种明显的优势有望发展成为强有力的新型检测技术
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种检测β 2激动剂的电化学β 2受体生物传感器，该传感器通过配体-受体的特异结合，实现对于β 2激动剂的检测。本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法。本发明的目的之三在于提供该传感器在检测β2激动剂中的应用。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种β 2受体生物传感器，为三电极体系传感器，对电极是钼电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于在所述的金电极上修饰有重组β2肾上腺素能受体，该重组β 2肾上腺素能受体该重组β 2肾上腺素能受体为SEQ ID NO:1所示的碱基序列。其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示
一种制备上述的β 2受体生物传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为:
a.将预处理好的金电极浸入ImM巯基丙酸MPA溶液中修饰过夜；
b.将步骤a所得的金电极浸入含400mM 1_乙基_3_ (3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐EDC、200 mM N-羟基琥珀酰亚胺NHS的水溶液中10 min，超纯水彻底清洗后浸入含100 mM组氨酸的水溶液中10 min,超纯水清洗；
c.将步骤b所得金电极浸入Iμ g/mL的氧化镍(NiO)纳米颗粒水溶液中10 min,超纯水清洗；
d.将步骤c所得金电极浸入0.27mg/mL的增溶β 2受体蛋白水溶液中10 30 min,经超纯水清洗得到经β 2受体修饰的金电极；
e.将步骤d所得金电极作为工作电极与钼电极和饱和甘汞电极一起组成三电极体系的β 2受体生物传感器。上述的增容β 2受体蛋白的制备方法是:
a.将β2受体基因的重组工程菌细胞膜用1% DDMN-十二烷基-β -D-麦芽苷-PBS缓冲液进行增溶处理，O C 45min，18000g离心20min，取上清液即为均质的增溶β 2受体蛋白溶液；
b.将步骤a所得增溶β2受体溶液加入Ni2+-NTA亲和柱吸附，经50mM咪唑高盐缓冲液洗柱三次后用200mM咪唑高盐缓冲液洗脱，部分收集即获得β 2受体蛋白。一种检测β 2激动剂的方法， 采用上述的β 2受体生物传感器进行检测，其特征在于该方法的具体步骤为:
a.将工作电极浸入到含有待测样品中，O C，30 min，超纯水清洗；
b.在20 C温度下，将经步骤a后的工作电极浸入到5.0 mL检测缓冲溶液中，所述的检测缓冲溶液为浓度为0.5 M的K3Fe(CN)6/ K4Fe (CN) 6的磷酸盐缓冲液，其pH为7.4。c.循环伏安法进行电化学扫描；参数设置:扫描范围-0.1 "0.55 V,扫描速率100mV/s0本发明首先利用β 2受体作“靶”，建立一种受体-配体检测系统，理论上可检测所有的β 2激动剂，同时由于β 2激动剂行使功能是通过β 2受体介导，因此该系统既具有高通量和广谱性“生物芯片”的技术效果，同时还具有生物功能检测的含义。该受体-配体检测系统具有如下优点:1.高特异性一受体与配体的结合具有严格的立体构象互补性。
2.高亲和力一受体-配体系统亲和力一般高于抗原-抗体系统。3.高通量一基于抗原-抗体系统的检测技术只能检出一种β 2激动剂，而基于受体-配体系统的检测技术可一次检出所有种类的β 2激动剂，将其“一网打尽”。利用基因重组技术可在酵母细胞高效表达β 2受体基因，表达产物β 2受体定位于细胞膜，作为膜蛋白行使功能。在β2受体-配体检测系统中的“靶”，既可以是该基因重组细胞的膜，也可以是分离纯化的受体蛋白，二者各有特点。前者制备工艺简单，但由于细胞膜成分复杂，导致检测系统特异性和灵敏度不够高；后者制备工艺精细复杂，但成分单一，构建的检测系统特异性和灵敏度都比前者高。本发明的突出特点主要在于，基于循环伏安技术，在工作电极上修饰纯化增溶的β 2受体蛋白，以此作为分子识别元件构建了三电极体系的电化学β 2受体生物传感器，与先前申请的细胞膜修饰工作电极(“一种电化学受体生物传感器及其应用”(申请号200910196550.4))的系统相比，本发明进一步通过分离、纯化技术，以获得的β 2受体蛋白作为分子识别元件构建了新型电化学β 2受体生物传感器，具有更高的特异性和灵敏度。能更好满足目前对β 2激动剂现场检测的迫切需要，为食品安全检测提供新的技术平台，可用于进出口检验检疫、食品卫生监管、畜牧饲养场等现场检测，具有广阔的市场应用前景和较大的经济、社会效益。
图1为采用空载宿主细胞膜工作电极(对照2)组成的电化学生物传感器对六种系列浓度的CLE进行独立循环伏安法扫描结果。(a) O, (b) 1，(c) 10，(d) 100，(e) 1000，(f) 10000。图2为采用β 2受体细胞膜工作电极(对照I)组成的电化学生物传感器对六种系列浓度的CLE进行独立循环伏安法扫描结果。(a) O, (b) 1，(c) 10，(d) 100，(e) 1000，(f) 10000。图3为采用β 2受体蛋白工作电极；CLE的浓度(pM)组成的电化学生物传感器对六种系列浓度的CLE进行独立循环伏安法扫描结果。(a) O, (b) l,(c)10，⑷100 ,Ce)1000，(f) 10000。图4为图1中三种电化学生物传感器峰值电流变化值与CLE浓度对数的关系曲线。(A)空载宿主细胞膜工作电极(对照2) ; (B) β 2受体细胞膜工作电极(对照I) ; (C)β 2 受体蛋白工作电极；CLE 的浓度(pM): (a) 0，(b) 1，(c) 10，⑷ 100，(e) 1000，(f)10000。
具体实施例方式实施例一:增溶β 2受体的纯化及制备
人β 2受体基因在毕赤酵母中的克隆、表达，以及重组工程菌细胞膜的制备见“建立一种β 2-激动剂的新的检测系统的研究”(戴小峰，上海大学硕士研究生论文，2004)，和“一种电化学受体生物传感器及其应用”(陈宇光等，发明专利申请号200910196550.4，2009)ο增溶β 2受体蛋白的制备:将上述重组工程菌细胞膜用1% DDM (N-十二烷基-β -D-麦芽苷)-PBS缓冲液进行增溶处理，O C 45min, 18000g离心20min，取上清液即为均质的增溶β 2受体蛋白。增溶β 2受体蛋白的部分纯化:将上述增溶β 2受体溶液加入Ni2+-NTA亲和柱吸附，经50mM咪唑高盐缓冲液洗柱三次后用200mM咪唑高盐缓冲液洗脱，部分收集即获得β 2受:体蛋白。实施例二: β 2受体工作电极的制备
金电极的预处理:金电极首先在5000目的金相砂纸上打磨，再用粒径由大到小1.0μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的氧化招粉末的悬池液抛光,使金电极表面成光滑镜面,取出分别在无水乙醇和超纯水中超声5min，然后将金电极放入0.5 M的H2SO4中进行循环伏安扫描(0-1.5 V电压范围)，扫速设置为100 mV/s，约20圈达到稳定。然后在氮气中吹干电极，得到表面清洁的裸金电极。β 2受体工作电极的制备:
a.将上述裸金电极 浸入ImM巯基丙酸(MPA)溶液中修饰过夜；
b.将上述(a)修饰金电极浸入含400mM EDC (1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐)、200 mM NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)的水溶液中10 min，超纯水彻底清洗后浸入含100 mM组氨酸的水溶液中10 min,超纯水清洗；
c.将上述(b)修饰金电极浸入1μ g/mL的氧化镍(NiO)纳米颗粒水溶液中10 min,超纯水清洗；
d.将上述(c)修饰金电极浸入纯化增溶β2受体溶液(0.27mg/mL) 10-30 min,经超纯水清洗得到β 2受体工作电极；
e.将步骤d所得β2受体工作电极与钼电极和饱和甘汞电极一起组成三电极体系的电化学β 2受体生物传感器。实施例三:电化学β 2受体生物传感器应用于β 2激动剂(克伦特罗)的检测 操作程序:在该三电极电化学传感器的体系中
a.将上述所得β2受体工作电极浸入到含有100 UL β 2激动剂的待测样品溶液或阴性对照溶液中，O C，30 min，超纯水清洗；
b.将上述a.反应后的β2受体工作电极浸入5.0 mL检测缓冲溶液(20 C)，检测缓冲溶液为:0.5 M K3Fe (CN) 6/ K4Fe (CN) 6 的磷酸盐缓冲液(50 mM, pH 7.4)。c.循环伏安法进行电化学扫描；参数设置:扫描范围-0.1^0.55 V,扫描速率100mV/s。β 2激动剂(克伦特罗)的检测特征:
分别制备克伦特罗(CLE)的六种系列浓度(0，1，10，100，1000，10000 pM)。分别制备三种工作电极，即β 2受体蛋白工作电极，β 2受体细胞膜工作电极(对照1)，空载宿主细胞膜工作电极(对照2)。该三种工作电极组成了三种生物传感器。使用这三种工作电极组成的电化学生物传感器分别对六种系列浓度的CLE进行独立循环伏安法扫描。结果表明:
1、线性检测1.0Χ10_12Μ至1.0Χ10-8 M 5个数量级范围(图3、图4 CO)；
2、检测浓度下限达0.1nM (0.03ppb)(图3、图4 (C))；
3、响应快速，灵敏度高，β2受体生物传感器比β 2受体细胞膜工作电极(对照I)提高近十倍，参见表1。
权利要求
1.一种β 2受体生物传感器，为三电极体系传感器，对电极是钼电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于在所述的金电极上修饰有重组β 2肾上腺素能受体，该重组β 2肾上腺素能受体为SEQ ID NO:1所示的碱基序列。
2.一种制备根据权利要求1所述的β 2受体生物传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为: a.将预处理好的金电极浸入ImM巯基丙酸MPA溶液中修饰过夜； b.将步骤a所得的金电极浸入含400mM 1_乙基_3_ (3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐EDC、200 mM N-羟基琥珀酰亚胺NHS的水溶液中10 min，超纯水彻底清洗后浸入含100 mM组氨酸的水溶液中10 min,超纯水清洗； c.将步骤b所得金电极浸入Iμ g/mL的氧化镍(NiO)纳米颗粒水溶液中10 min,超纯水清洗； d.将步骤c所得金电极浸入0.27mg/mL的增溶β 2受体蛋白水溶液中10-30 min,经超纯水清洗得到经β 2受体修饰的金电极； e.将步骤d所得金电极作为工作电极与钼电极和饱和甘汞电极一起组成三电极体系的β 2受体生物传感器。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的增容β2受体蛋白的制备方法是: a.将β2受体基因的重组工程菌细胞膜用1% DDMN-十二烷基-β -D-麦芽苷-PBS缓冲液进行增溶处理，O C 45min，18 000g离心20min，取上清液即为均质的增溶β 2受体蛋白溶液； b.将步骤a所得增溶β2受体溶液加入Ni2+-NTA亲和柱吸附，经50mM咪唑高盐缓冲液洗柱三次后用200mM咪唑高盐缓冲液洗脱，部分收集即获得β 2受体蛋白。
4.一种检测β 2激动剂的方法，采用根据权利要求1所述的β 2受体生物传感器进行检测，其特征在于该方法的具体步骤为: a.将工作电极浸入到含有待测样品中，O C，30 min，超纯水清洗； b.在20 C温度下，将经步骤a后的工作电极浸入到5.0 mL检测缓冲溶液中，所述的检测缓冲溶液为浓度为0.5 M的K3Fe(CN)6/ K4Fe (CN) 6的磷酸盐缓冲液，其pH为7.4。
c.循环伏安法进行电化学扫描；参数设置:扫描范围-0.Γ0.55 V，扫描速率100 mV/So
全文摘要
本发明涉及一种β2受体生物传感器、制备方法及其应用。本β2受体生物传感器，为三电极体系传感器，对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于在所述的金电极上修饰有重组β2肾上腺素能受体，该重组β2肾上腺素能受体为SEQ ID NO1所示的碱基序列。本发明不仅减少了该电化学生物传感器出现假阴性的检测结果，也进一步提高了检测的灵敏度，能更好满足目前对β2激动剂现场检测的迫切需要，为食品安全检测提供了新的技术平台，可用于进出口检验检疫、食品卫生监管、畜牧饲养场等现场检测，具有广阔的市场应用前景和较大的经济、社会效益。
文档编号G01N27/327GK103196970SQ20131009469
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月22日 优先权日2012年8月10日
发明者苏洁, 沈敏, 戴小峰, 郭敏, 顾鸣, 陈宇光 申请人:上海大学