血浆样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法
【专利摘要】本发明涉及一种血浆样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法，所述测定方法包括：血浆样品前处理步骤：在0～4℃下，按体积比为1：5混合动物给予2,3-吲哚醌后采集的血浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30～90秒后离心取上清液；以及通过液相色谱-质谱联用对经前处理的血浆样品进行检测的检测步骤，其中液相色谱条件包括：色谱柱为Ascentis，RP-Amide，5μm，50×2.1mm；色谱流动相A为5mM甲酸铵/5mM甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积百分比分别为55%和45%；质谱条件包括：质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为50psi；气体流速为9L/min；毛细管电压为4500V；离子源温度为350℃，内标法定量。
【专利说明】血浆样品中2, 3-吲哚醌的浓度的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药检测领域，涉及一种内源性活性化合物2，3_吲哚醌的生物体内血浆样品中的浓度的测定方法。
【背景技术】
[0002]2，3-Π引哚醌(2，3-1ndolined1ne, Isatin, ISA),又名靛红,是近年发现存在于人和动物体内的一种内源性活性因子,具有多种生物活性。
[0003]液相色谱与质谱联用技术(LC-MS)，尤其是其中的液相色谱-大气压电离质谱联用技术(LC-AP1-MS)，是目前分析生物样品中痕量物质的首选。它兼具了液相色谱与质谱两种技术的优点，具有高灵敏度和专一性，，并大大缩短分析时间。
[0004]目前，已有报道的2，3-吲哚醌测定方法有ECL、GC-MS、LC-MS以及HPLC等方法，这些方法大多样品前处理复杂，有些需要对生物样品进行多步纯化处理，实验操作过程比较繁琐，而且样品分析时间较长，被用于2，3-吲哚醌的体内药代动力学研究中大批生物样品的分析测试方法还很少，且存在以上问题，因此在处理药代动力学研究中所产生的大量样品就需要开发高通量的快速分析方法，特别是样品前处理简便、检测手段灵敏的快速分析方法。例如中国专利CN102735764A公开一种血浆中利巴韦林含量的测定方法，该方法使用较为简便的血浆预处理方法，并使用LC-MS法检测，灵敏度较高。但是目前关于血浆样品中2，3-吲哚醌浓度的快速简便灵敏的测定方法还鲜有报道。
【发明内容】
[0005]基于2，3-吲哚醌的临床前药代动力学研究中存在的生物样品浓度分析方法中的问题，本发明的目的在于提供一种高通量快速检测血浆中2，3-吲哚醌浓度的一种液质联用分析方法。
[0006]在此，本发明提供一种血浆样品中2，3-吲哚醌的浓度的测定方法，包括:
血浆样品前处理步骤:
在O?4°C下，按体积比为1:5混合动物给予2，3-吲哚醌后采集的血浆样品(含2，3-吲哚醌的血浆样品)和内标溶液，涡旋30?90秒后离心取上清液，其中所述内标溶液为10ng/mL的奎硫平甲醇溶液；通过液相色谱_质谱联用对经前处理的血浆样品进行检测的检测步骤，其中
液相色谱条件包括:色谱柱为Ascentis, RP-Amide, 5 μ m, 50 X 2.1mm ;色谱流动相A为5mM甲酸铵/5mM甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积百分比分别为55%和45% ；
质谱条件包括:质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为50psi ;气体流速为9L/min ;毛细管电压为4500V ;离子源温度为350°C，内标法定量。
[0007]本发明通过甲醇蛋白沉淀法处理血浆样品，用液相色谱质谱联用仪器分析血浆样品中2，3-吲哚醌的浓度。因此，本发明的方法具有前处理简便、检测手段灵敏专一、检测速度快的优点。本发明的方法的准确度、精密度及检测限符合生物样品分析方法学验证要求，能够满足2，3-吲哚醌的药代动力学研究中血浆样品的浓度测定需要。
[0008]在所述血浆样品前处理步骤中，所述内标物甲醇溶液优选为10ng/mL的奎硫平甲醇溶液。又，所述离心优选为以15000r/min的速度离心5min。
[0009]又，在所述检测步骤中，所述液相色谱条件还包括:柱温为40°C ；自动进样器温度为6°C ;洗针液为异丙醇水溶液，其中，异丙醇与水的体积比为1:1 ;分析时间为2分钟,流速为400 μ L/min,进样量为5 μ L。
[0010]在所述检测步骤中，所述质谱条件还包括:用于定量分析的离子对为:2，3-吲哚醌:148 — 65.1 ;奎硫平:384.1 — 253.1。
[0011]本发明中，所述血浆样品是哺乳动物的血浆。
[0012]在一个示例中，所述血浆样品是动物给予2，3-吲哚醌后采集的新鲜血浆样品。
[0013]在又一个示例中，所述血浆样品是动物给予2，3-吲哚醌后采集的血浆样品存放于-80°C冰箱的储备血浆样品，所述血浆样品前处理步骤还包括在与所述内标物甲醇溶液混合前先将所述储备血浆样品从_80°C冰箱取出，于O?4°C下自然融化后漩涡20?40秒。
[0014]本发明中，所述测定方法的最低检测限为10ng/mL。能够满足于低含量2，3_吲哚醌的检测。
[0015]本发明中，所述测定方法的相对误差和相对标准偏差均在20%以内，重现性和可靠性较高，具有较高的稳定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是大鼠血浆中选择性样品色谱图，其中图1 (a)是空白血浆的2，3_吲哚醌色谱图，图1 (b)是空白血浆的奎硫平色谱图，图1 (C)是空白血浆加内标的2，3-吲哚醌色谱图，图1 (d)是空白血浆加内标的奎硫平色谱图；
图2是大鼠血浆中最低定量下限样品色谱图，其中图2 Ca)是2，3-吲哚醌色谱图，图
2(b)是奎硫平色谱图；
图3是大鼠血浆系统残留样品色谱图，其中图3 (a)是2，3-吲哚醌色谱图，图3 (b)是奎硫平色谱图；
图4是Beagle犬(比格犬)血浆中选择性样品色谱图，其中图4 Ca)是空白血浆的2，3-吲哚醌色谱图，图4 (b)空白血浆的是奎硫平色谱图，图4 (c)是空白血浆加内标的2，3-吲哚醌色谱图，图4 Cd)是空白血浆加内标的奎硫平色谱图；
图5是Beagle犬(比格犬)血浆中最低定量下限样品色谱图，其中图5 (a)是2，3_吲哚醌色谱图，图5 (b)是奎硫平色谱图；
图6是Beagle犬(比格犬)血浆系统残留样品色谱图，其中图6 Ca)是2，3_吲哚醌色谱图，图6 (b)是奎硫平色谱图。
【具体实施方式】
[0017]以下，参照附图，并结合下述实施方式进一步说明本发明。应理解这些实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明。
[0018]本发明提供了一种高通量快速检测血浆中2，3-吲哚醌浓度的一种液质联用分析方法，涉及:(I)血浆样品的蛋白沉淀前处理方法；(2)血浆样品中2，3-吲哚醌标准曲线的制备；(3)液相色谱分离方法；(4)质谱检测方法；(5)结果的计算。
[0019]本发明通过甲醇蛋白沉淀法处理血浆样品，用液相色谱质谱联用仪器分析血浆样品中2，3-吲哚醌的浓度。本方法的准确度，精密度及检测限符合生物样品分析方法学验证要求，能够满足2，3-吲哚醌的药代动力学研究中血浆样品的浓度测定需要。
[0020]作为一个示例，本发明的方法可涉及以下方面。
[0021](I)血浆样品的蛋白沉淀前处理:取50 μ L血浆样品至1.5mL离心管中，加入250 μ L内标溶液(例如，10ng/mL奎硫平甲醇溶液)，涡旋30~90秒后离心(例如15000r/min，离心5分钟4°C);取上清液100 μ L至Agilent色谱进样小瓶中。整个前处理过程在40C (或冰上(约为O~4°C))下进行。血浆样品可以是从哺乳动物(例如大鼠或犬)中取出的新鲜血浆，将其直接置于冰上进行上述前处理，也可以将从哺乳动物中取出的新鲜血浆预先保存在-80 V冰箱中，需要用的时候从-80 V冰箱中取出样品，在4°C (或冰上(约为O~4°C))自然溶化后涡旋30秒后再与内标溶液混合。
[0022](2)标准曲线样品的配制:
a)2，3-吲哚醌储备液(Stock A)的配制:精密称取2，3-吲哚醌标准品1.30mg,置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为260 μ g/mL的2，3-吲哚醌储备液(Stock A)，储存在4°C冰箱中待用；
b)2，3-吲哚醌标准溶液的配制:将2，3-吲哚醌储备液(Stock A)用甲醇稀释到200 μ g/mL,然后用甲醇逐级稀释，配制成2，3-吲哚醌浓度为100，40，20，10, 4，2，0.4 μ g/mL的标准溶液，如表1，其中表1中的CSS表示标准曲线样品添加溶液(Calibrat1nStandard Spiking Solut1n)，
表1，2，3-吲哚醌标准溶液配制:
【权利要求】
1.一种血浆样品中2，3-吲哚醌的浓度的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括:血浆样品前处理步骤: 在O?4°C下，按体积比为1:5混合动物给予2，3-吲哚醌后采集的血浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30?90秒后离心取上清液；以及 通过液相色谱-质谱联用对经前处理的血浆样品进行检测的检测步骤，其中 液相色谱条件包括:色谱柱为Ascentis, RP-Amide, 5 μ m, 50 X 2.1mm ;色谱流动相A为5mM甲酸铵/5mM甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积百分比分别为55%和45% ； 质谱条件包括:质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为50psi ;气体流速为9L/min ;毛细管电压为4500V ;离子源温度为350°C，内标法定量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，在所述血浆样品前处理步骤中，所述内标物甲醇溶液为10ng/mL的奎硫平甲醇溶液。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述血浆样品前处理步骤中，所述离心是以15000r/min的速度离心5min。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的测定方法，其特征在于，液相色谱条件还包括:柱温为40°C ；自动进样器温度为6°C ;洗针液为异丙醇水溶液，其中异丙醇与水的体积比为I:1 ;分析时间为2分钟，流速为400μ L/min，进样量为5μ L。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述质谱条件还包括:用于定量分析的离子对为'2, 3-吲哚醌:148 — 65.1 ;奎硫平:384.1 — 253.1。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述血浆样品是哺乳动物的血浆。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述血浆样品是动物给予2，3-吲哚醌后采集的新鲜血浆样品。
8.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述血浆样品是动物给予2，3-吲哚醌后采集的血浆样品存放于-80°C冰箱的储备血浆样品，所述血浆样品前处理步骤还包括在与所述内标物甲醇溶液混合前先将所述储备血浆样品从_80°C冰箱取出，于O?4°C下自然融化后镟涡20?40秒。
9.根据权利要求1?8中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法的最低检测限为10ng/mL。
10.根据权利要求1?9中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法的相对误差和相对标准偏差均在20%以内。
【文档编号】G01N30/02GK104133004SQ201310161192
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年5月3日 优先权日:2013年5月3日
【发明者】陈春麟, 吕文旭, 王涛, 陈昊, 汪俊 申请人:上海美迪西生物医药有限公司