具有条件活性的抗表皮生长因子受体抗体及其使用方法

具有条件活性的抗表皮生长因子受体抗体及其使用方法
【专利摘要】本发明提供了修饰的抗-EGFR抗体及编码修饰的抗-EGFR抗体的核酸分子。本发明还提供了使用抗-EGFR抗体的治疗方法和应用。
【专利说明】具有条件活性的抗表皮生长因子受体抗体及其使用方法
[0001] 相关申请
[0002] 要求美国临时申请序列号61/685,089的优先权，该申请题目为"Conditionally Active anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibodies and Methods of Use Thereof"，申请日为2012年3月8日。
[0003] 此申请涉及美国专利申请第13/815,553号，申请日与本文相同，题目为 "Conditionally Active anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibodies and Methods of Use Thereof，"其要求美国临时申请序列号61/685, 089的优先权。
[0004] 此申请还涉及 Lalitha Kodandapani、Louis Howard Bookbinder、Gregory I. Frost、Philip Lee Sheri dan > Harold Michael SheparcUGe Wei 和 Lei Huang 的，题 目为 "METHODS FOR ASSESSING AND IDENTIFYING OR EVOLVING CONDITIONALLY ACTIVE THERAPEUTIC PROTEINS"的，申请日为2011年9月27日的美国专利申请第13/200,666 号，其是 Lalitha Kodandapani、Louis Howard Bookbinder、Gregory I. Frost、Philip Lee Sheridan、Harold Michael Shepard、Ge Wei 和 Lei Huang 的，题目为 "METHODS FOR ASSESSING AND IDENTIFYING OR EVOLVING CONDITIONALLY ACTIVE THERAPEUTIC PROTEINS"的，申请日为2011年9月27日的国际申请第PCT/US11/50891号的部分连续申 请，其要求 Lalitha Kodandapani、Phi lip Lee Sher i dan > Haro Id Michael SheparcULouis H-Bookbinder 和 Gregory I. Frost 的，题目为"METHODS FOR ASSESSING AND IDENTIFYING OR EVOLVING CONDITIONALLY ACTIVE THERAPEUTIC PROTEINS AND CONDITIONALLY ACTIVE THERAPEUTIC PROTEINS"的，申请日为2010年9月8日的美国临时申请序列号61/402,979 的优先权。
[0005] 上述各申请的主题通过引用全文并入。
[0006] 通过引用并入的电子序列表
[0007] 在此提交电子版的序列表，其内容通过引用全文并入。该电子文件制备于2013年 3月8日，大小为1237千字节，题目为3104seqPCl. txt。 发明领域
[0008] 本文提供了具有条件活性的抗-EGFR抗体，包括修饰的抗-EGFR抗体，及编码具有 条件活性的抗-EGFR抗体，包括修饰的抗-EGFR抗体的核酸分子。本文还提供了使用所述 具有条件活性的抗-EGFR抗体的治疗方法。

【背景技术】
[0009] 抗-EGFR抗体在临床中用于治疗和诊断人体疾病，例如癌症。例如，示例性的治疗 性抗体包括西妥昔单抗。西妥昔单抗被许可用于治疗复发或转移的头颈癌、结肠直肠癌及 其它疾病和病症。其也可用于治疗涉及EGFR过表达或者EGFR信号或活化异常的其它疾病 或病症。所施用的抗-EGFR抗体在健康细胞和组织中可以结合EGFR。这样限制了可以施用 的剂量。因此，当给患者施用时，西妥昔单抗及其它抗-EGFR抗体呈现出受限性。因此，本 文的目的是提供改良的抗-EGFR抗体。
[0010] 发明概述
[0011] 本文提供了具有条件活性的抗-表皮生长因子受体（EGFR)抗体及其抗原结合片 段。所述抗体及其片段是具有条件活性的，因此其在靶组织如具有酸性PH的肿瘤微环境中 与在非靶组织如具有大约7-7. 2的中性pH的非肿瘤组织环境如在皮肤基底层中相比呈现 出更高的活性。通常地，用作抗肿瘤疗法的抗-EGFR抗体结合EGFR受体并抑制基于配体结 合发生的EGFR-介导的活性。结果，其可抑制或治疗肿瘤。由于除了肿瘤之外的组织如皮 肤中组织也表达EGFR，因此抗-EGFR抗体抑制这些受体的活性，从而导致不希望的副作用。 本文提供的抗体是具有条件活性的，其在非肿瘤微环境（例如中性P?中呈现的活性与非 具有条件活性的抗体相比和/或与其在肿瘤微环境中的活性相比降低。凭借对肿瘤微环境 的选择性，其呈现出较少或较小的不希望的副作用和/或由于可以使用较高剂量而呈现出 改良的效力。
[0012] 本文提供了抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其在肿瘤微环境条件下是具有条件 活性的，其中在肿瘤环境条件下与在非肿瘤环境条件下相比，所述抗-EGFR抗体或其抗原 结合片段呈现出对人表皮生长因子受体（EGFR)或其可溶片段的结合活性至少3. 0的比率。 在这样的实例中，肿瘤环境条件含有5. 6-6. 8或大约5. 6-6. 8的pH或者5mM-20mM或大约 5mM-20mM的乳酸盐浓度两者或两者之一，及蛋白质浓度为10mg/mL-50mg/mL ;非肿瘤环境 条件含有7. 0-7. 8或大约7. 0-7. 8的pH或者0. 或大约0. 的乳酸盐浓度两 者或两者之一，及蛋白质浓度为10mg/mL-50mg/mL。例如，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合 片段呈现出在pH为5. 6-6. 8或大约5. 6-6. 8的肿瘤微环境条件下与在pH为7. 0-7. 8或大 约7. 0-7. 8的非肿瘤微环境条件下的活性比率。在另一实例中，所述抗-EGFR抗体或其抗 原结合片段呈现出在pH为6. 0-6. 5或大约6. 0-6. 5的肿瘤微环境条件下与在pH大约7. 4 的非肿瘤微环境条件下的活性比率。在一些情况中，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段 呈现出在乳酸盐浓度为5mM-20mM或大约5mM-20mM的肿瘤微环境条件下与在乳酸盐浓度为 0. 或大约0. 的非肿瘤微环境条件下的活性比率。在本文特别的实例中，权 利要求1-4任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出在pH为6. 0-6. 5及乳酸盐浓 度为10mM-20mM的肿瘤微环境条件下与在pH为7. 0-7. 4及乳酸盐浓度为0. 的非 肿瘤微环境条件下的活性比率。
[0013] 在任何这样的实例中，存在或者在存在蛋白质浓度为10mg/mL-50mg/mL或大约 10mg/mL-50mg/mL的条件下存在所述结合活性比率，其中所述蛋白质浓度在肿瘤微环境条 件下与在非肿瘤微环境条件下基本相同或相同。例如，所述蛋白质浓度为至少12mg/mL、 15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL 或 50mg/mL〇 所述蛋白质 可以是血清白蛋白，如人血清白蛋白。所述蛋白质是在血清如人血清中提供的。例如，血 清的浓度是20%(￥〇1八〇1)-90(%(￥〇1八〇1)、20(%(￥〇1八〇1)-50 (%(￥〇1八〇1)或者20(% (vol/vol)-40% (vol/vol)，例如其低于90% (vol/vol)，大约为或者至少为或者为20% (vol/vol) >25% (vol/vol) >30% (vol/vol) >35% (vol/vol) >40% (vol/vol) >45% (vol/ vol)或50% (vol/vol)。在特别的实例中，在含有血清浓度如人血清浓度为低于为大约 25% (vol/vol)的条件下存在所述活性比率。
[0014] 在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何上述实例中，所述结 合活性比率是在肿瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下相比的活性比率，其在能测量 或评估与人EGFR或其可溶片段的结合活性的任何测定中确定。例如，结合活性是在固相结 合测定中体外确定的。所述固相结合测定可以是免疫测定，如酶联免疫吸附测定（ELISA)。 在这样的实例中，所述结合活性是对结合的分光光度测量，所述结合活性比率是浓度抗体 相同，在肿瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下相比的结合的分光光度测量的比率， 例如抗体浓度为 Ing/mL-lOOng/mL 或大约 Ing/mL-lOOng/mL。
[0015] 在其它实例中，结合活性是使用生物传感器确定的解离常数（Kd)，并且如果在肿 瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下相比亲和性高至少3倍，则所述抗体或其抗原结 合片段呈现出的比率为至少3。在这样的实例中，抗-EGFR抗体或其抗原结合片段典型地 在肿瘤微环境中具有解离常数（Kd)低于1xKT8M、5X10_9M、1x1(T 9M、5X KTkiMUXKTkK 5 X l(TnM、I X KT11M或更低。在进一步的实例中，结合活性是使用生物传感器确定的解离速 率（off-rate)，如果在肿瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下相比解离速率减慢至少 3倍，则所述抗体或其抗原结合片段呈现出的比率为至少3。在任何这样的使用生物传感器 的实例中，所述生物传感器可以是Biacore传感器或者Octet传感器，或者本领域技术人员 已知的其它相似的生物传感器。
[0016] 在本文进一步的实例中，结合活性是在表达EGFR的肿瘤微环境中或者在表达 EGFR的非肿瘤微环境中在对象中体内评估的。在这样的实例中，所述非肿瘤微环境是表达 人EGFR的皮肤基底层。这种体内结合活性可以在非人动物对象中确定，其中所述肿瘤微环 境是表达人EGFR的人肿瘤异种移植物，非肿瘤微环境是表达人EGFR的人皮肤异种移植物。 例如，所述人肿瘤异种移植物是A431异种移植物。在这样的实例中，所述抗-EGFR抗体或 其抗原结合片段可以荧光标记，在这两种条件下的结合活性以荧光信号强度确定，所述荧 光信号强度确定可以根据对照IgG标准化。
[0017] 在本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何实例中，所述活性比率为至 少 3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60 或 更高。
[0018] 在本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何实例中，所述抗-EGFR抗体 或其抗原结合片段含有可变重链和轻链，所述可变重链与其最接近的人Vh基因节段种系序 列呈现至少56%的序列相同性，所述轻链与其最接近的人'基因节段种系序列呈现出至少 75 %序列相同性。
[0019] 例如，本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是这样的抗体，其含有：可 变重链（VH),其具有 SEQ ID N0:495、1062、1112、1114-1118、1124-1126、1128-1130、 1134-1137 或 1146-1152 所示的氨基酸序列或者与 SEQ ID NO :495、1062、1112、1114-1118、 1124-1126、1128-1130、1134-1137、或1146-1152所示的序列具有至少85%序列相同性的 氨基酸序列；及可变轻链（VL)，其具有SEQ ID NO :4、10、1138-1145、1153-1159或1186所 示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO :4、10、1138-1145、1153-1159或1186所示的序列具有至 少85%序列相同性的氨基酸序列。
[0020] 例如，本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是这样的抗体，其含有：
[0021] a)SEQ ID NO :495或者与SEQ ID NO :495呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0022] b)SEQ ID NO :1062或者与SEQ ID NO :1062呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0023] c)SEQ ID NO :1112或者与SEQ ID NO :1112呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0024] d)SEQ ID NO :1114或者与SEQ ID NO :1114呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0025] e)SEQ ID NO :1115或者与SEQ ID NO :1115呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0026] f)SEQ ID NO :1116或者与SEQ ID NO :1116呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0027] g)SEQ ID NO :1117或者与SEQ ID NO :1117呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0028] h)SEQ ID NO :1124或者与SEQ ID NO :1124呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0029] i)SEQ ID NO :1125或者与SEQ ID NO :1125呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0030] j)SEQ ID NO :1126或者与SEQ ID NO :1126呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0031] k)SEQ ID NO :1128或者与SEQ ID NO :1128呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0032] 1)SEQ ID NO :1129或者与SEQ ID NO :1129呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0033] m)SEQ ID NO :1130或者与SEQ ID NO :1130呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0034] n)SEQ ID NO :1134或者与SEQ ID NO :1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1138或者与SEQ ID NO :1138呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0035] o)SEQ ID NO :1134或者与SEQ ID NO :1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1139或者与SEQ ID NO :1139呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0036] p)SEQ ID NO :1135或者与SEQ ID NO :1135呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1138或者与SEQ ID NO :1138呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0037] q)SEQ ID NO :1134或者与SEQ ID NO :1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1140或者与SEQ ID NO :1140呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0038] r)SEQ ID NO :1134或者与SEQ ID NO :1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1141或者与SEQ ID NO :1141呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0039] s)SEQ ID NO :1134或者与SEQ ID NO :1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1142或者与SEQ ID NO :1142呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0040] t)SEQ ID NO :1135或者与SEQ ID NO :1135呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1142或者与SEQ ID NO :1142呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0041] u)SEQ ID NO :1134或者与SEQ ID NO :1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1143或者与SEQ ID NO :1143呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0042] v)SEQ ID NO :1136或者与SEQ ID NO :1136呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1142或者与SEQ ID NO :1142呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0043] w)SEQ ID NO :1137或者与SEQ ID NO :1137呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1144或者与SEQ ID NO :1144呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0044] x)SEQ ID NO :1136或者与SEQ ID NO :1136呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1144或者与SEQ ID NO :1144呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0045] y)SEQ ID NO :1137或者与SEQ ID NO :1137呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1145或者与SEQ ID NO :1145呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0046] z)SEQ ID NO :1136或者与SEQ ID NO :1136呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1145或者与SEQ ID NO :1145呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0047] aa) SEQ ID NO :1146或者与SEQ ID NO :1146呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1153或者与SEQ ID NO :1153呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0048] bb) SEQ ID NO :1147或者与SEQ ID NO :1147呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1153或者与SEQ ID NO :1153呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0049] cc) SEQ ID NO :1148或者与SEQ ID NO :1148呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1154或者与SEQ ID NO :1154呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0050] dd)SEQ ID NO :1149或者与SEQ ID NO :1149呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1154或者与SEQ ID NO :1154呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0051] ee) SEQ ID NO :1150或者与SEQ ID NO :1150呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1155或者与SEQ ID NO :1155呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0052] ff) SEQ ID NO :1151或者与SEQ ID NO :1151呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1156或者与SEQ ID NO :1156呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0053] gg) SEQ ID NO :1146或者与SEQ ID NO :1146呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1156或者与SEQ ID NO :1156呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0054] hh) SEQ ID NO :1149或者与SEQ ID NO :1149呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1156或者与SEQ ID NO :1156呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0055] ii) SEQ ID NO :1150或者与SEQ ID NO :1150呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1157或者与SEQ ID NO :1157呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0056] jj) SEQ ID NO :1152或者与SEQ ID NO :1152呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1157或者与SEQ ID NO :1157呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0057] kk) SEQ ID NO :1148或者与SEQ ID NO :1148呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1157或者与SEQ ID NO :1157呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0058] 11) SEQ ID NO :1149或者与SEQ ID NO :1149呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1157或者与SEQ ID NO :1157呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0059] mm) SEQ ID NO :1150或者与SEQ ID NO :1150呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1186或者与SEQ ID NO :1186呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0060] nn) SEQ ID NO :1152或者与SEQ ID NO :1152呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1186或者与SEQ ID NO :1186呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0061] 〇〇) SEQ ID NO :1148或者与SEQ ID NO :1148呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1186或者与SEQ ID NO :1186呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0062] pp) SEQ ID NO :1149或者与SEQ ID NO :1149呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1186或者与SEQ ID NO :1186呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0063] qq) SEQ ID NO :1150或者与SEQ ID NO :1150呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1158或者与SEQ ID NO :1158呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0064] rr) SEQ ID NO :1152或者与SEQ ID NO :1152呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1159或者与SEQ ID NO :1159呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0065] ss) SEQ ID NO :1146或者与SEQ ID NO :1146呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1159或者与SEQ ID NO :1159呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0066] tt) SEQ ID NO :1146或者与SEQ ID NO :1146呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1157或者与SEQ ID NO :1157呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0067] uu) SEQ ID NO :1146或者与SEQ ID NO :1146呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :1186或者与SEQ ID NO :1186呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链；
[0068] vv) SEQ ID NO :1118或者与SEQ ID NO :1118呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变重链，及SEQ ID NO :4或10或者与SEQ ID NO :4或10呈现至少85%序列 相同性的氨基酸序列所示的可变轻链。
[0069] 33.权利要求31或32的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中序列相同性为至 少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98%、99% 或更1?。
[0070] 本文提供的任何抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是抗体或其抗原结合片段，其能 在哺乳动物细胞中表达，所述细胞含有编码所述抗体的核酸，所述抗体的浓度为至少Img/ mL，例如至少 L 5mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、I Omg/mL 或更1?。
[0071] 本文提供的任何抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是这样的抗体，其是修饰的 抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。例如，本文提供的具有条件活性抗-EGFR抗体是这样的 抗-EGFR抗体及其抗原结合片段，其是不呈现出这种具有条件活性或者呈现粗较低程度具 有条件活性的抗-EGFR抗体的变体。因此，本文提供的抗体是修饰形式的治疗性抗体，特 指西妥昔单抗及西妥昔单抗的其它变体，如其人源化形式及其它形式（见例如公开的国际 PCT 串请号 TO2011059762、TO2005056606A2、TO2006009694、TO2010080463、W02012020059、 W02008152537、W09640210 及美国专利号 7, 060, 808、7, 723, 484 和 7, 930, 107,这些专 利描述了抗-EGFR抗体）。因此，未修饰的抗体可以是西妥昔单抗抗体、其抗原结合片 段和变体，其不包括所述氨基酸置换并特异性结合EGFR(见例如在任何公开的国际PCT 申请号 W02011059762、W02005056606A2、W02006009694、W02010080463、W02012020059、 W02008152537、W09640210 和美国专利号 7, 060, 808、7, 723, 484 和 7, 930, 107 及其它同族 申请/专利中描述的那些抗-EGFR抗体）。所述修饰的抗-EGFR抗体及其片段在肿瘤微环 境中是具有条件活性的。
[0072] 所述具有条件活性的抗体如修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段包括在未修 饰的抗体的可变重链、可变轻链或者这二者中或者在其抗原结合片段的这种区域中具有氨 基酸置换的那些抗体。在一些实例中，所述未修饰的抗-EGFR抗体是西妥昔单抗、其抗原结 合片段或其变体，其不包括所述氨基酸置换并特异性结合EGFR。在特定的实例中，在除了 pH不同之外相同的条件下测量时，在pH6. 0-pH 6. 5或大约pH 6. 0-pH 6. 5与在pH 7. 4或 大约pH 7. 4相比，所述修饰的抗-EGFR抗体及其片段可呈现出与EGFR的结合活性至少2. 0 的比率。在一些实例中，在相同条件下测量时，所述修饰的抗-EGFR抗体在pH 7. 4与未修 饰的抗体在pH 7. 4相比呈现出低于40%的EGFR结合活性，条件是所述修饰的抗-EGFR抗 体及其片段不包括：a)可变重链，其包括选自N31I、N31V、V50L、Y59E和T64N的氨基酸置 换；或者b)可变轻链，其包括氨基酸置换L4C。
[0073] 在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体及其片段的任何实例中，在相同条件下测量 时，所述修饰的抗-EGFR抗体在pH 6. 0-pH 6. 5或大约pH 6. 0-pH6. 5与未修饰的抗体在pH 6. 0-pH 6. 5相比呈现出至少20 %的EGFR结合活性。
[0074] 在所述修饰的抗-EGFR抗体及其片段的任何实例中，所述可变重链或其部分包括 对应选自如下参照SEQ ID NO :3所示的氨基酸位置的氨基酸置换的氨基酸置换：HC-V24E、 HC-V24I、HC-V24L、HC-S25C、HC-S25H、HC-S25R、HC-S25A、HC-S25D、HC-S25G、HC-S25M、 HC-S25Q、HC-S25V、HC-S25L、HC-S28C、HC-L29H、HC-N31H、HC-G54D、HC-G54S、HC-F63R、 HC-F63C、HC-F63M、HC-F63P、HC-F63S、HC-T64V、HC-L67G、HC-D72L、HC-D72P、HC-D72W、 HC-N73Q、HC-K75H、HC-K75G、HC-K75P、HC-K75W、HC-S76I、HC-S76V、HC-Q77E、HC-T100P、 HC-Y104D、HC-Y104S、HC-Y104V、HC-Q111I、HC-Q111V。对应的氨基酸位置可以通过比对所述 抗体的VH链与SEQ ID NO :3所示的VH链而鉴定。所述其部分可以足以形成抗原结合位点 并包括所述氨基酸置换。在一些实例中，所述修饰的可变轻链或其部分包括对应选自如下 参照SEQ ID N0:4所示的氨基酸位置的氨基酸置换的氨基酸置换：LC-L4F、LC-L4V、LC-T5P 和LC-R24G。对应的氨基酸位置可以通过比对所述抗体的VL链与SEQ ID NO :4所示的VL 链而鉴定，且所述其部分可以是足以形成抗原结合位点并包括所述氨基酸置换。
[0075] 本文提供的修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段还包括具有未修饰的抗体的 可变轻链的互补决定区（CDR)L2中一或多个氨基酸残基的氨基酸置换的那些抗体。在本 文提供的修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段中，可变轻链或其部分可包括对应选自如 下的对应SEQ ID N0:4所示的氨基酸残基的氨基酸置换的氨基酸置换：LC-A51T、LC-A51L、 LC-S52A、LC-S52C、LC-S52D、LC-S52E、LC-S52G、LC-S52I、LC-S52M、LC-S52Q、LC-S52V、 LC-S52W、LC-S52R、LC-S52K、LC-E53G、LC-S54M、LC-I55A、LC-I55F、LC-S56G、LC-S56L、 LC-S56A、LC-S56C、LC-S56D、LC-S56E、LC-S56F、LC-S56N、LC-S56P、LC-S56Q、LC-S56V、 LC-S56W、LC-S56H、LC-S56R和LC-S56K。所述其部分可以足以形成抗原结合位点并包括所 述氨基酸置换。在本文提供的任何修饰的抗-EGFR抗体及其片段的一些实例中，所述修饰 的抗-EGFR抗体及其片段在肿瘤微环境中是具有条件活性的。
[0076] 所述修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段还包括任何这样的抗体，其包括未修 饰的抗体的可变重链（VH)、可变轻链（VL)或者这二者中氨基酸置换。在本文提供的修饰的 抗-EGFR抗体的一些实例中，所述未修饰的抗-EGFR抗体是西妥昔单抗、其抗原结合片段或 其变体，其不包括所述氨基酸置换并特异性结合EGFR。所述VH链中的氨基酸置换残基可以 出现在对应选自参照SEQ ID NO :3所示的氨基酸位置的例如26、36、66、69、75、93、94、109、 IlOUll和112位置的氨基酸残基的氨基酸位置，对应的氨基酸位置通过比对所述抗体的 VH链与SEQ ID NO :3所示的VH链而鉴定。在一些实例中，所述VL链中氨基酸置换可出现 在对应选自参照SEQ ID NO :4所示的氨基酸位置的29、48、51、52、53、55、56、86和98位置 的氨基酸残基的氨基酸位置，对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体的VL链与SEQ ID NO: 4所示的VL链而鉴定。在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体及其片段的一些实例中，所述修 饰的抗-EGFR抗体及其片段在肿瘤微环境中是具有条件活性的。
[0077] 本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是任何这样的抗体，其中可变 重链或其部分包括对应选自如下参照SEQ ID NO :3所示的氨基酸残基的氨基酸置换的氨 基酸置换：G26H、G026R、G026D、G026F、G026M、G026N、G026P、G026Q、G026S、G026Y、G026L、 W036K、W036A、W036I、W036V、W036Y、R066L、R066A、R066C、R066E、R066F、R066N、R066P、 R066Q、R066S、R066T、R066V、R066G、I069A、I069C、I069G、I069Y、K075H、K075R、K075L、 K075A、K075C、K075E、K075F、K75G、K075M、K75P、K075Q、K075T、K075V、K075W、K075Y、Y093H、 Y093V、Y093W、Y094R、Y094L、W109I、W109M、W109Y、G110R、G110A、G110M、G110P、G110T、 Q111K、Q111H、Q111R、Q111L、Q111D、Q111E、Q111G、Q111I、Q111M、Q111P、Q111S、Q111T、 Q111V、Q111W、Q111Y、G112A、G112N、G112P、G112S、G112T 和 HC-G112Y，且所述其部分足以 形成抗原结合位点并包括所述氨基酸置换；和/或所述可变轻链或其部分包括对应选自如 下参照SEQ ID NO :4所示的残基的氨基酸置换的氨基酸置换：I029A、I029E、I029F、I029S、 I029T、I029R、I048M、I048S、I048L、I048K、A051T、A051L、S052A、S052C、S052D、S052E、 S052G、S052I、S052M、S052Q、S052V、S052W、S052R、S052K、E53G、I055A、I055F、S056G、S056L、 S056A、S056C、S056D、S056E、S056F、S056N、S056P、S056Q、S056V、S056W、S056H、S056R、 S056K、Y086F、Y086M、Y086H、R)98A、R)98M、R)98S、R)98V 和 R)98Y，且所述其部分足以形成 抗原结合位点并包括所述氨基酸置换。
[0078] 在本文的任何实例中，修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段在pH 6. 0或pH 6. 5 与在pH 7. 4或大约pH 7. 4相比的结合活性比率为至少1. 1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、 I. 8、1. 9、2. 0、2. 5、3. 0、4. 0、4. 5、5. 0或更高。在本文的任何实例中，本文提供的修饰的 抗-EGFR抗体及其抗原结合片段在pH 6. 0-pH 6. 5或大约pH 6. 0-pH 6. 5与在pH 7. 4或大 约pH 7. 4相比当在除了 pH不同之外的相同条件下测量时呈现出至少2.0倍的更高的EGFR 结合活性。
[0079] 在本文的任何实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段在 pH7. 4与包括如SEQ ID NO :3所示的可变重链及如SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :10所示的可 变轻链的西妥昔单抗抗体对应的形式在PH 7. 4相比可以呈现出降低的EGFR结合活性，结 合活性是在相同条件下测量的。例如，所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段可呈现 出低于西妥昔单抗抗体对应的形式的结合活性的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、 20 %或更低的结合活性。
[0080] 在本文的任何实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段在pH 6. 0-6. 5或大约pH 6. 0-6. 5与包括如SEQ ID NO :3所示的可变重链及如SEQ ID NO :4或 SEQ ID NO :10所示的可变轻链的西妥昔单抗抗体对应的形式在pH 7. 4相比可呈现出增 加的EGFR结合活性，结合活性是在相同条件下测量的。例如，修饰的抗-EGFR抗体或其抗 原结合片段可呈现出高于西妥昔单抗抗体对应的形式的结合活性的 140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、350%、400%、500% 或更高 的结合活性。
[0081] 本文提供的抗-EGFR抗体还包括修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其包括 在未修饰的抗体的可变重链（VH)、可变轻链（VL)或者这二者中的氨基酸置换。在一些实 例中，所述未修饰的抗-EGFR抗体是西妥昔单抗、其抗原结合片段或者其变体，其不包括 所述氨基酸置换并特异性结合EGFR。所述VH链或者其部分可包括对应选自如下参照SEQ

【权利要求】
1. 抗-EGFR抗体，或者其抗原结合片段，其中： 在肿瘤环境条件下和在非肿瘤环境条件下相比，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段 呈现出与人表皮生长因子受体（EGFR)或者其可溶性片段的结合活性至少3. 0的比率； 肿瘤环境条件包括5. 6-6. 8或大约5. 6-6. 8的pH或者5mM-20mM或大约5mM-20mM的 乳酸盐浓度两者或两者之一，及10mg/mL-50mg/mL的蛋白质浓度； 非肿瘤环境条件包括7. 0-7. 8或大约7. 0-7. 8的pH或者0. 或大约0. 的乳酸盐浓度两者或两者之一，及10mg/mL-50mg/mL的蛋白质浓度，从而所述抗-EGFR抗体 或其片段在肿瘤微环境条件下是有条件活性的。
2. 权利要求1的抗-EGFR抗体或者其抗原结合片段，其中在包括5. 6-6. 8或大约 5. 6-6. 8的pH的肿瘤微环境条件下和在包括7. 0-7. 8或大约7. 0-7. 8的pH的非肿瘤微环 境下相比，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出所述活性比率。
3. 权利要求1或2的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中在包括pH6. 0-6. 5或大 约6. 0-6. 5的肿瘤微环境条件下与在包括大约7. 4的pH的非肿瘤微环境下相比，所述 抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出所述活性比率。
4. 权利要求1-3任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中在包括5mM-20mM或大 约5mM-20mM的乳酸盐浓度的肿瘤微环境条件下与在包括0. 或大约0. 的 乳酸盐浓度的非肿瘤微环境下相比，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出所述活性 比率。
5. 权利要求1-4任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中在包括6. 0-6. 5的pH 及10mM-20mM的乳酸盐浓度的肿瘤微环境条件下与在包括7. 0-7. 4的pH及0. 的 乳酸盐浓度的非肿瘤微环境下相比，所述权利要求1-4任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结 合片段呈现出所述活性比率。
6. 权利要求1-5任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中在肿瘤微环境条件下 与在非肿瘤微环境条件下的蛋白质浓度是基本相同或者是相同的。
7. 权利要求1-6任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述蛋白质浓度为至 少 12mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL或 50mg/mL〇
8. 权利要求1-7任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述蛋白质是血清白 蛋白。
9. 权利要求1-8任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述蛋白质是人血清 白蛋白。
10. 权利要求1-9任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述蛋白质是在血清 中提供的。
11. 权利要求10的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中血清的浓度为20% (vol/ vol)_90% (vol/vol)、20% (vol/vol)_50% (vol/vol)或者 20% (vol/vol)_40% (vol/ vol) 〇
12. 权利要求10或11的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中血清的浓度低于90% (vol/vol)，且大约是或者至少是或者是 20% (vol/vol)、25% (vol/vol)、30% (vol/vol)、 35% (vol/vol)、40% (vol/vol)、45% (vol/vol)或 50% (vol/vol)。
13. 权利要求10-12任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中血清的浓度是或者 大约是 25% (vol/vol)。
14. 权利要求10-13任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述血清是人血 清。
15. 权利要求1-14任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述结合活性是在 体外在固相结合测定中确定的。
16. 权利要求1-15任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述固相结合测定 是免疫测定。
17. 权利要求1-16任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫测定是酶 联免疫吸附测定（ELISA)。
18. 权利要求1-17任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中： 所述结合活性是对结合的分光光度测定法测量；及 所述结合活性比率是在相同抗体浓度下，肿瘤微环境条件下与非肿瘤微环境条件下相t匕，对结合的分光光度测定法测量的比率。
19. 权利要求18的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体浓度是或大约是 1ng/mT,~100ng/mT,n
20. 权利要求1-14任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中： 所述结合活性是使用生物传感器确定的解离常数（KD);及 如果在肿瘤微环境条件下与非肿瘤微环境条件下相比有至少高3倍的亲和性，则所述 抗体或其抗原结合片段呈现出至少是3的比率。
21. 权利要求20的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述解离常数（KD)在存在 于肿瘤微环境的条件下低于 1X10_8M、5X10_9M、1X10_9M、5X10_1QM、1X10_1QM、5X10_nM、 lX10_nM或更低。
22. 权利要求1-14任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中： 所述结合活性是使用生物传感器确定的解离速率；及 如果所述解离速率在肿瘤微环境条件下与非肿瘤微环境条件下相比减慢至少3倍，则 所述抗体或其抗原结合片段呈现出至少是3的比率。
23. 权利要求20-22任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述生物传感器是 Biacore传感器或者Octet传感器。
24. 权利要求1-14任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中： 结合活性是在对象中表达EGFR的肿瘤微环境中或者在表达EGFR的非肿瘤微环境中体 内评估的。
25. 权利要求24的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述非肿瘤微环境是表达人 EGFR的皮肤基底层。
26. 权利要求24或25的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中： 所述对象是非人动物； 所述肿瘤微环境包含表达人EGFR的人肿瘤异种移植物；及 所述非肿瘤微环境包含表达人EGFR的人皮肤异种移植物。
27. 权利要求26的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述人肿瘤异种移植物是 A431异种移植物。
28. 权利要求24-27任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中： 所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是荧光标记的；及 结合活性是荧光信号强度。
29. 权利要求1-28任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述活性比率为至 少 3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60 或 更高。
30. 权利要求1-29任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中： 可变重链的VH区与其最接近的人VH基因节段种系序列呈现出至少56%序列相同性； 及 轻链的 '区与其最接近的人'基因节段种系序列呈现出至少75%序列相同性。
31. 权利要求1-30任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其包含： a) 可变重链（VH)，其包含SEQIDN0:495、1062、1112、1114-1118、1124-1126、 1128-1130U134-1137 或 1146-1152 所示氨基酸序列，或者与SEQIDN0:495、1062、1112、 1114-1118、1124-1126、1128-1130、1134-1137、或 1146-1152 所示任何序列呈现至少85% 序列相同性的氨基酸序列；以及 b) 可变轻链（VL)，其包含SEQID勵:4、10、1138-1145、1153-1159或1186所示氨基酸 序列，或者与SEQIDN0:4、10、1138-1145、1153-1159或1186所示序列呈现出至少85%序 列相同性的氨基酸序列。
32. 权利要求1-31任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其选自如下抗体，所述抗 体包含： a)SEQIDNO:495或者与SEQIDNO:495呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所示 的可变重链，及SEQIDN0:4或10或者与SEQIDN0:4或10呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； b)SEQIDNO: 1062或者与SEQIDNO: 1062呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDN0:4或10或者与SEQIDN0:4或10呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链； c)SEQIDNO: 1112或者与SEQIDNO: 1112呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDN0:4或10所示或者与SEQIDN0:4或10呈现至少85%序列相 同性的氨基酸序列所示的可变轻链； d)SEQIDNO: 1114或者与SEQIDNO: 1114呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDN0:4或10或者与SEQIDN0:4或10呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链； e)SEQIDNO: 1115或者与SEQIDNO: 1115呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDN0:4或10或者与SEQIDN0:4或10呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链； f)SEQIDNO: 1116或者与SEQIDNO: 1116呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDN0:4或10或者与SEQIDN0:4或10呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链； g)SEQIDNO: 1117或者与SEQIDNO: 1117呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID N0:4或10或者与SEQ ID N0:4或10呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链； h) SEQ ID NO: 1124或者与SEQ ID NO: 1124呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID N0:4或10或者与SEQ ID N0:4或10呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链； i) SEQ ID NO: 1125或者与SEQ ID NO: 1125呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID N0:4或10或者与SEQ ID N0:4或10呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链； j) SEQ ID NO: 1126或者与SEQ ID NO: 1126呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID N0:4或10或者与SEQ ID N0:4或10呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链； k) SEQ ID NO: 1128或者与SEQ ID NO: 1128呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID N0:4或10或者与SEQ ID N0:4或10呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链； l) SEQ ID NO: 1129或者与SEQ ID NO: 1129呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID N0:4或10或者与SEQ ID N0:4或10呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链； m) SEQ ID NO: 1130或者与SEQ ID NO: 1130呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID N0:4或10或者与SEQ ID N0:4或10呈现至少85%序列相同性 的氨基酸序列所示的可变轻链； n) SEQ ID NO: 1134或者与SEQ ID NO: 1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID NO: 1138或者与SEQ ID NO: 1138呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； o) SEQ ID NO: 1134或者与SEQ ID NO: 1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID NO: 1139或者与SEQ ID NO: 1139呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； p) SEQ ID NO: 1135或者与SEQ ID NO: 1135呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID NO: 1138或者与SEQ ID NO: 1138呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； q) SEQ ID NO: 1134或者与SEQ ID NO: 1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID NO: 1140或者与SEQ ID NO: 1140呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； r) SEQ ID NO: 1134或者与SEQ ID NO: 1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID NO: 1141或者与SEQ ID NO: 1141呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； s) SEQ ID NO: 1134或者与SEQ ID NO: 1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQ ID NO: 1142或者与SEQ ID NO: 1142呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； t) SEQ ID NO: 1135或者与SEQ ID NO: 1135呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDNO: 1142或者与SEQIDNO: 1142呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； u)SEQIDNO: 1134或者与SEQIDNO: 1134呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDNO: 1143或者与SEQIDNO: 1143呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； v)SEQIDNO: 1136或者与SEQIDNO: 1136呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDNO: 1142或者与SEQIDNO: 1142呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； w)SEQIDNO: 1137或者与SEQIDNO: 1137呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDNO: 1144或者与SEQIDNO: 1144呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； x)SEQIDNO: 1136或者与SEQIDNO: 1136呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDNO: 1144或者与SEQIDNO: 1144呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； y)SEQIDNO: 1137或者与SEQIDNO: 1137呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDNO: 1145或者与SEQIDNO: 1145呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； z)SEQIDNO: 1136或者与SEQIDNO: 1136呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列所 示的可变重链，及SEQIDNO: 1145或者与SEQIDNO: 1145呈现至少85%序列相同性的氨 基酸序列所示的可变轻链； aa)SEQIDNO: 1146或者与SEQIDNO: 1146呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQIDNO: 1153或者与SEQIDNO: 1153呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； bb)SEQIDNO: 1147或者与SEQIDNO: 1147呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQIDNO: 1153或者与SEQIDNO: 1153呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； cc)SEQIDNO: 1148或者与SEQIDNO: 1148呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQIDNO: 1154或者与SEQIDNO: 1154呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； dd)SEQIDNO: 1149或者与SEQIDNO: 1149呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQIDNO: 1154或者与SEQIDNO: 1154呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； ee)SEQIDNO: 1150或者与SEQIDNO: 1150呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQIDNO: 1155或者与SEQIDNO: 1155呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； ff)SEQIDNO: 1151或者与SEQIDNO: 1151呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQIDNO: 1156或者与SEQIDNO: 1156呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； gg)SEQIDNO: 1146或者与SEQIDNO: 1146呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID NO: 1156或者与SEQ ID NO: 1156呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； hh)SEQ ID NO: 1149或者与SEQ ID NO: 1149呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID NO: 1156或者与SEQ ID NO: 1156呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； ii)SEQ ID NO: 1150或者与SEQ ID NO: 1150呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID NO: 1157或者与SEQ ID NO: 1157呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； jj)SEQ ID NO: 1152或者与SEQ ID NO: 1152呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID NO: 1157或者与SEQ ID NO: 1157呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； kk)SEQ ID NO: 1148或者与SEQ ID NO: 1148呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID NO: 1157或者与SEQ ID NO: 1157呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； 11. SEQ ID NO: 1149或者与SEQ ID NO: 1149呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID NO: 1157或者与SEQ ID NO: 1157呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； mm) SEQ ID NO: 1150或者与SEQ ID NO: 1150呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID NO: 1186或者与SEQ ID NO: 1186呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； nn)SEQ ID NO: 1152或者与SEQ ID NO: 1152呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID NO: 1186或者与SEQ ID NO: 1186呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； 〇〇) SEQ ID NO: 1148或者与SEQ ID NO: 1148呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID NO: 1186或者与SEQ ID NO: 1186呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； pp)SEQ ID N0:1149或者与SEQ ID N0:1149呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID NO: 1186或者与SEQ ID NO: 1186呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； qq)SEQ ID N0:1150或者与SEQ ID N0:1150呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID N0:1158或者与SEQ ID N0:1158呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； rr)SEQ ID N0:1152或者与SEQ ID N0:1152呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID N0:1159或者与SEQ ID N0:1159呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； ss)SEQ ID N0:1146或者与SEQ ID N0:1146呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQ ID N0:1159或者与SEQ ID N0:1159呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； tt)SEQ ID N0:1146或者与SEQ ID N0:1146呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQIDNO: 1157或者与SEQIDNO: 1157呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； uu)SEQIDNO: 1146或者与SEQIDNO: 1146呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQIDNO: 1186或者与SEQIDNO: 1186呈现至少85%序列相同性的 氨基酸序列所示的可变轻链； vv)SEQIDNO: 1118或者与SEQIDNO: 1118呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列 所示的可变重链，及SEQIDN0:4或10或者与SEQIDN0:4或10呈现至少85%序列相同 性的氨基酸序列所示的可变轻链。
33. 权利要求31或32的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中序列相同性为至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98%、99% 或 更高。
34. 权利要求1-33任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原 结合片段以至少lmg/mL的浓度在哺乳动物细胞中表达。
35. 权利要求1-34任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其是修饰的抗-EGFR抗 体或其抗原结合片段，所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段包含在未修饰的抗体的 可变重链、可变轻链或者这二者中的氨基酸置换，其中 ： 所述未修饰的抗-EGFR抗体是西妥昔单抗、其抗原结合片段或变体，其不包含所述氨 基酸置换并特异性结合EGFR。
36. 修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其包含在未修饰抗体的可变重链、可变轻 链或这二者中的氨基酸置换，其中： 所述未修饰的抗-EGFR抗体是西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体，其不包含所述 氨基酸置换并特异性结合EGFR; 当在除了 pH不同之外的相同条件下测量时，在pH6. 0-pH6. 5或大约pH6. 0-pH6. 5与在 pH7. 4或大约pH7. 4相比，所述修饰的抗-EGFR抗体或其片段呈现出的EGFR结合活性比率 为至少2. 0 ;及 当在相同条件下测量时，所述修饰的抗-EGFR抗体在pH7. 4与所述未修饰的抗体在 PH7. 4相比呈现出低于40%的EGFR结合活性，条件是所述修饰的抗-EGFR抗体或其片段不 包含： a) 可变重链，其包含选自N31I、N31V、V50L、Y59E和T64N的氨基酸置换；或者 b) 可变轻链，其包含氨基酸置换L4C。
37. 权利要求36的修饰的抗-EGFR抗体或其片段，其中当在相同条件下测量时，所述修 饰的抗-EGFR抗体在或大约在pH6. 0-pH6. 5与未修饰的抗体在pH6. 0-pH6. 5相比呈现出至 少20 %的EGFR结合活性。
38. 权利要求35-37任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其片段，其中： a)所述可变重链或其部分含有氨基酸置换，所述氨基酸置换对应于选自如下参照SEQ IDNO: 3 所示的氨基酸位置的氨基酸置换：V24E、V24I、V24L、S25C、S25H、S25R、S25A、S2?、 S25G、S25M、S25Q、S25V、S25L、S28C、L29H、N31H、G54D、G54S、F63R、F63C、F63M、F63P、F63S、 T64V、L67G、D72L、D72P、D72W、N73Q、K75H、K75G、K75P、K75W、S76I、S76V、Q77E、T100P、Y104D、 Y104S、Y104V、Q111I、Q111V，其中 对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体的VH链与SEQIDNO: 3所示的VH链而鉴定的， 及 所述其部分足以形成抗原结合位点及含有所述氨基酸置换；和/或b)所述修饰的可变轻链或其部分含有氨基酸置换，所述氨基酸置换对应于选自参照 5￡〇10勵:4所示的氨基酸位置的14?、14￥、了5?、1?246的氨基酸置换，其中 ： 对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体的VL链与SEQIDN0:4所示的VL链而鉴定的， 所述其部分足以形成抗原结合位点及含有所述氨基酸置换。
39. 权利要求35-38任一项的修饰的抗-EGFR抗体，其中所述可变重链或其部分含有氨 基酸置换Y104D。
40. 权利要求38或39的修饰的抗-EGFR抗体，其中： 所述可变重链或其部分含有选自V24E、S25C、S25V、F27R、T30F、S53G、D72L、R97H、Y104D和Q111P的进一步的氨基酸置换。
41. 修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其包含至少两个氨基酸置换，其中： 所述氨基酸置换是在未修饰的抗体的可变重链（VH)、可变轻链（VL)或者这二者中， 所述未修饰的抗-EGFR抗体是西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体，其不包含所述 氨基酸置换及特异性结合EGFR; 所述VH链中的氨基酸置换对应于选自参照SEQIDNO: 3所示的氨基酸位置的V24E、S25C、S25V、F27R、T30F、S53G、D72L、R97H、Y104D和Q111P的氨基酸置换，其中对应的氨基 酸位置是通过比对所述抗体的VH链与SEQIDNO: 3所示的VH链而鉴定的，及 所述VL链中的氨基酸置换对应参照SEQIDN0:4所示的氨基酸位置的氨基酸置换I29S，其中对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体的VL链与SEQIDN0:4所示的VL链而 鉴定的。
42. 权利要求39-41任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述氨基酸 置换是HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25C/HC-Y104D、HC-Y104D/LC-I29S、HC-Y104D/HC-Q111P/ LC-I29S、HC-S53G/HC-Y104D、HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25V/HC-Y104D、HC-S25V/ HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104D、HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、 HC-T30F/HC-Y104D、HC-T30F/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104D、HC-T30F/ HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-D72L/HC-Y104D、HC-D72L/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S53G/ HC-D72L/HC-Y104D或者HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104D/HC-Q111P。
43. 权利要求40或41的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述氨基酸 置换是HC-S25C/HC-Q111P、HC-V24E/HC-F27R/HC-R97H/HC-Q111P、HC-S25C/LC-I29S和 HC-Q111P/LC-I29S。
44. 权利要求41-43任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中在 pH6. 0-pH6. 5或大约pH6. 0-pH6. 5与在pH7. 4或大约pH7. 4相比，所述修饰的抗-EGFR抗 体或其片段呈现出的EGFR结合活性比率为至少1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5、1. 6、1. 7、1. 8、L9、 2. 0、2. 5、3. 0、4. 0、4. 5、5. 0 或更！H]。
45. 权利要求44的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中在pH6. 0-pH6. 5或大 约pH6. 0-pH6. 5与在pH7. 4或大约pH7. 4相比，所述修饰的抗-EGFR抗体或其片段呈现出 的EGFR结合活性比率为至少2. 0。
46. 权利要求45的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述氨基酸置换 是HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25C/HC-Y104D、HC-S53G/HC-Y104D、HC-S53G/HC-Y104D/ HC-Q111P、HC-S25V/HC-Y104D、HC-S25V/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104D、 HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-T30F/HC-Y104D、HC-T30F/HC-Y104D/HC-Q111P、 HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104D、HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-D72L/HC-Y104D、 HC-D72L/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104D或HC-S53G/HC-D72L/ HC-Y104D/HC-Q111P。
47. 权利要求35-46任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述未修饰 的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体包含SEQIDNO:3所示的可变重链及SEQID NO:4或10所示的可变轻链。
48. 权利要求35-47任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述未修饰 的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体包含： 具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列或者与SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列呈现至少 85%序列相同性的氨基酸序列的重链，及具有SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列或者与SEQ IDN0:2所示的氨基酸序列呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列的轻链；或者 具有SEQIDN0:8所示的氨基酸序列或者与SEQIDN0:8所示的氨基酸序列呈现至少 85%序列相同性的氨基酸序列的重链，及具有SEQIDN0:9所示的氨基酸序列或者与SEQ IDN0:9所示的氨基酸序列呈现至少85%序列相同性的氨基酸序列的轻链。
49. 权利要求35-48任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述未修饰 的西妥昔单抗是人源化的变体。
50. 权利要求49的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述未修饰的西妥昔 单抗包含SEQIDN0:28所示的可变重链及SEQIDN0:29所示的可变轻链。
51. 权利要求35-47任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述未修饰 的西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体是其抗原结合片段，并且所述抗原结合片段选自 Fab、Fab'、F(ab'） 2、单链？￥(8。?￥)、？￥、(18?￥、双特异抗体、？(1和？(1'片段。
52. 权利要求51的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述未修饰的西妥昔 单抗是Fab片段，其包含具有SEQIDNO: 5所示的氨基酸序列或者与SEQIDNO: 5所示的 氨基酸序列具有至少75%序列相同性的氨基酸序列的重链，及具有SEQIDN0:2所示的氨 基酸序列或者与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少75%序列相同性的氨基酸序列的 轻链。
53. 权利要求36-52任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其包含： a) 可变重链（VH)，其包含SEQIDN0:495、1062、1112、1114、1115、1116、1117、1118、 1119、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130 或 1131 所示的氨基酸序列，或者与SEQID NO:495、1062、1112、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1124、1125、1126、1127、1128、1129、 1130或1131所示的序列具有至少85%序列相同性的氨基酸序列；及 b) 可变轻链（VL)，其包含SEQIDN0:4或10所示的氨基酸序列，或者与SEQIDN0:4 或10所示的序列具有至少85%序列相同性的氨基酸序列。
54. 权利要求35-53任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其包含： a)可变重链（VH)，其包含SEQIDNO: 1062或1125所示的氨基酸序列，或者与SEQID NO: 1062或1125所示的序列具有至少85%序列相同性的氨基酸序列；及 b)可变轻链（VL)，其包含SEQIDN0:4或10所示的氨基酸序列，或者与SEQIDN0:4 或10所示的序列具有至少85%序列相同性的氨基酸序列。
55. 权利要求1-54任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其是人源化的。
56. 权利要求55的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中： 所述可变重链与SEQIDN0:3所示的可变重链呈现出低于85%序列相同性及与SEQID N0:3所示的可变重链呈现出高于65%序列相同性；及 所述可变轻链与SEQIDN0:4所示的可变轻链呈现出低于85%序列相同性及与SEQID N0:4所示的可变轻链呈现出高于65%序列相同性。
57. 权利要求55或56的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其包含选自如下的氨基酸序 列： a) SEQIDNO: 1134或者与SEQIDNO: 1134呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1138或者与SEQIDNO: 1138呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； b)SEQIDNO: 1134或者与SEQIDNO: 1134呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1139或者与SEQIDNO: 1139呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； c)SEQIDNO: 1135或者与SEQIDNO: 1135呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1138或者与SEQIDNO: 1138呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； d)SEQIDNO: 1134或者与SEQIDNO: 1134呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1140或者与SEQIDNO: 1140呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； e)SEQIDNO: 1134或者与SEQIDNO: 1134呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1141或者与SEQIDNO: 1141呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； f)SEQIDNO: 1134或者与SEQIDNO: 1134呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1142或者与SEQIDNO: 1142呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； g) SEQIDNO: 1135或者与SEQIDNO: 1135呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1142或者与SEQIDNO: 1142呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； h)SEQIDNO: 1134或者与SEQIDNO: 1134呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1143或者与SEQIDNO: 1143呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； i)SEQIDNO: 1136或者与SEQIDNO: 1136呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1142或者与SEQIDNO: 1142呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； j)SEQIDNO: 1137或者与SEQIDNO: 1137呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1144或者与SEQ ID NO: 1144呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； k) SEQ ID NO: 1136或者与SEQ ID NO: 1136呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1144或者与SEQ ID NO: 1144呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； l) SEQ ID NO: 1137或者与SEQ ID NO: 1137呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1145或者与SEQ ID NO: 1145呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； m) SEQ ID NO: 1136或者与SEQ ID NO: 1136呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1145或者与SEQ ID NO: 1145呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； n) SEQ ID NO: 1146或者与SEQ ID NO: 1146呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1153或者与SEQ ID NO: 1153呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； o) SEQ ID NO: 1147或者与SEQ ID NO: 1147呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1153或者与SEQ ID NO: 1153呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； p) SEQ ID NO: 1148或者与SEQ ID NO: 1148呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1154或者与SEQ ID NO: 1154呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； q) SEQ ID NO: 1149或者与SEQ ID NO: 1149呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1154或者与SEQ ID NO: 1154呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； r) SEQ ID NO: 1150或者与SEQ ID NO: 1150呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1155或者与SEQ ID NO: 1155呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； s) SEQ ID NO: 1151或者与SEQ ID NO: 1151呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1156或者与SEQ ID NO: 1156呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； t) SEQ ID NO: 1146或者与SEQ ID NO: 1146呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1156或者与SEQ ID NO: 1156呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； u) SEQ ID NO: 1149或者与SEQ ID NO: 1149呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1156或者与SEQ ID NO: 1156呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； v) SEQ ID NO: 1150或者与SEQ ID NO: 1150呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQ ID NO: 1157或者与SEQ ID NO: 1157呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； w) SEQ ID NO: 1152或者与SEQ ID NO: 1152呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1157或者与SEQIDNO: 1157呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； x)SEQIDNO: 1148或者与SEQIDNO: 1148呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1157或者与SEQIDNO: 1157呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； y)SEQIDNO: 1149或者与SEQIDNO: 1149呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1157或者与SEQIDNO: 1157呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； z)SEQIDNO: 1150或者与SEQIDNO: 1150呈现至少85%序列相同性的序列所示的可 变重链，及SEQIDNO: 1186或者与SEQIDNO: 1186呈现至少85%序列相同性的氨基酸序 列所示的可变轻链； aa)SEQIDNO: 1152或者与SEQIDNO: 1152呈现至少85%序列相同性的序列所示的 可变重链，及SEQIDNO: 1186或者与SEQIDNO: 1186呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变轻链； bb)SEQIDNO: 1148或者与SEQIDNO: 1148呈现至少85%序列相同性的序列所示的 可变重链，及SEQIDNO: 1186或者与SEQIDNO: 1186呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变轻链； cc)SEQIDNO: 1149或者与SEQIDNO: 1149呈现至少85%序列相同性的序列所示的 可变重链，及SEQIDNO: 1186或者与SEQIDNO: 1186呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变轻链； dd)SEQIDNO: 1150或者与SEQIDNO: 1150呈现至少85%序列相同性的序列所示的 可变重链，及SEQIDNO: 1158或者与SEQIDNO: 1158呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变轻链； ee)SEQIDNO: 1152或者与SEQIDNO: 1152呈现至少85%序列相同性的序列所示的 可变重链，及SEQIDNO: 1159或者与SEQIDNO: 1159呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变轻链； ff)SEQIDNO: 1146或者与SEQIDNO: 1146呈现至少85%序列相同性的序列所示的 可变重链，及SEQIDNO: 1159或者与SEQIDNO: 1159呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变轻链； gg)SEQIDNO: 1146或者与SEQIDNO: 1146呈现至少85%序列相同性的序列所示的 可变重链，及SEQIDNO: 1157或者与SEQIDNO: 1157呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变轻链； hh)SEQIDNO: 1146或者与SEQIDNO: 1146呈现至少85%序列相同性的序列所示的 可变重链，及SEQIDNO: 1186或者与SEQIDNO: 1186呈现至少85%序列相同性的氨基酸 序列所示的可变轻链。
58. 权利要求53、54或57的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述序列相同性为 至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更 商。
59. 权利要求1-58任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其是全长IgG抗体。
60. 权利要求59的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其包含： SEQIDN0:22-25、1069和1070任一所示的重链恒定区或者与其具有至少85%序列相 同性的变体；及 SEQIDNO: 1072-1073任一所示的轻链恒定区或者与其具有至少85%序列相同性的变 体。
61. 权利要求1-58任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其是选自Fab、Fab'、 ?(813'）2、单链？￥(8〇?￥)、？￥、(^￥、双特异抗体、？(1和？(1'片段的抗原结合片段。
62. 权利要求61的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其是Fab或scFv。
63. 权利要求1-62任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其是分离的或纯化的。
64. -种缀合物，其包含与靶向剂直接或间接连接的权利要求1-63任一项的抗-EGFR 抗体或其抗原结合片段。
65. 权利要求64的缀合物，其包含如下成分： (Ab)、（L)jP(靶向剂）m，其中： Ab是与EGFR结合的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段； L是连接Ab与靶向剂的接头； m至少为1 ; q是〇或者更多，条件是所得缀合物与EGFR结合； 所得缀合物与EGFR结合。
66. 权利要求65的缀合物，其中m是1-8,且q是0-8。
67. 权利要求63-66的缀合物，其中所述靶向剂是蛋白质、肽、核酸或者小分子。
68. 权利要求63-67任一项的缀合物，其中所述靶向剂是治疗性部分。
69. 权利要求68的缀合物，其中所述治疗性部分是细胞毒性部分、放射性同位素、化疗 齐U、裂解肽或者细胞因子。
70. 权利要求69的缀合物，其中所述治疗性部分选自：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽 D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、 道诺霉素、二羟炭疽菌素二酮、美登素或其类似物或衍生物、阿里他汀或其功能性肽类似物 或衍生物、尾海兔素10或15或其类似物、伊立替康或其类似物、米托蒽醌、光神霉素、放线 菌素D、l-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、卡里 奇霉素或其类似物或衍生物、抗代谢物、烷化剂、钼衍生物、倍癌霉素A、倍癌霉素SA、雷查 霉素（CC-1065)或其类似物或衍生物、抗生素、吡咯[2, 1-c] [1，4]-苯并二吖庚因（PDB)、毒 素、核糖核酸酶（RNase)、DNaseI、葡萄球菌肠毒素A、及美洲商陆抗病毒蛋白。
71. 权利要求69或70的缀合物，其中所述治疗性部分是美登素衍生物，其是选自安丝 菌素或mertansine(DMl)的美登醇。
72. 权利要求69或70的缀合物，其中所述治疗性部分是阿里他汀或其功能性肽类似物 或其衍生物，其是一甲基阿里他汀E(MMAE)或F(MMAF)。
73. 权利要求69或70的缀合物，其中所述治疗性部分是抗代谢物，选自氨甲喋呤、6巯 基嘌呤、6硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5氟尿嘧啶、氨烯咪胺、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西 他滨和克拉屈滨。
74. 权利要求69或70的缀合物，其中所述治疗性部分是烷化剂，选自氮芥、噻替派、 苯丁酸氮芥、美法仑、亚硝脲氮芥（BCNU)、环己亚硝脲（CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露 醇、链脲霉素、氮烯唑胺（DTIC)、甲基苄肼和丝裂霉素C。
75. 权利要求69或70的缀合物，其中所述治疗性部分是钼衍生物，其是顺钼或卡钼。
76. 权利要求69或70的缀合物，其中所述治疗性部分是抗生素，选自更生霉素、博来 霉素、道诺霉素、阿霉素、伊达比星、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素和氨茴霉素 (AMC)。
77. 权利要求69或70的缀合物，其中所述治疗性部分是毒素，选自白喉毒素及其活 性片段和杂交分子、蓖麻蛋白毒素、霍乱毒素、志贺样毒素、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百 日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌属外毒素、alorin、阜草 素、蒴莲素、gelanin、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、a-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、石竹素蛋白、 美洲商陆蛋白、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚 霉素和依诺霉素毒素。
78. 权利要求64-77任一项的缀合物，其中所述抗体与靶向剂是直接连接的。
79. 权利要求64-77任一项的缀合物，其中所述抗体与靶向剂是通过接头连接的。
80. 权利要求79的缀合物，其中所述接头包含肽或多肽，或者是化学接头。
81. 权利要求79或80的缀合物，其中所述接头是可裂解的接头或者是不可裂解的接 头。
82. 权利要求79-81任一项的缀合物，其中所述接头与所述抗体上一或多个游离巯基 缀合。
83. 权利要求79-81任一项的缀合物，其中所述接头与一或多个伯胺缀合。
84. 核酸分子，其包含编码权利要求1-63任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的 核苷酸序列。
85. 核酸分子，其包含编码权利要求1-63任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的 重链的核苷酸序列。
86. 核酸分子，其包含编码权利要求1-63任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的 轻链的核苷酸序列。
87. 载体，其包含权利要求84-86任一项的核酸分子。
88. 细胞，其包含一或多个权利要求87的载体。
89. 权利要求88的细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。
90. 产生抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的宿主细胞中从编码 重链和轻链的一或多个权利要求87的载体表达所编码的重链或轻链，并回收所述抗体。
91. 权利要求90的方法，其中： 所编码的抗体或其抗原结合片段是权利要求26和48-55任一项的抗体或其抗原结合 片段；以及 所述宿主细胞产生高于lmg/mL的抗体。
92. -种组合，其包含： 权利要求1-63任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段或者权利要求64-83任一项 的缀合物，及 化疗剂或抗癌剂。
93. 权利要求92的组合，其中所述化疗剂选自烷化剂、硝基脲、拓扑异构酶抑制剂和抗 体。
94. 权利要求92的组合，其中所述化疗剂选自伊立替康、奥沙利钼、5-氟尿嘧啶 (5-FU)、希罗达、坎普土沙、乐沙定、阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺钼、吉西他滨和卡钼。
95. 权利要求92-94任一项的组合，其中所述化疗剂是与第一种抗体不同的另外的 抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。
96. 权利要求95的组合，其中所述另外的抗-EGFR抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼 妥珠单抗，及其抗原结合片段或其变体。
97. 试剂盒，其包含一或多个容器中的权利要求1-63任一项的抗体或其抗原结合片 段、权利要求64-83任一项的缀合物或者权利要求92-96任一项的组合，及使用说明书。
98. 药物组合物，其包含： 权利要求1-63任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段、权利要求64-83任一项的缀 合物或者权利要求92-96任一项的组合，以及 药物可接受的运载体或赋形剂。
99. 权利要求98的药物组合物，其配制为凝胶、软膏、液体、悬浮液、气雾剂、片剂、丸 齐U、粉末或者亲液胶体。
100. 权利要求98或99的药物组合物，其配制为用于全身、肠道外、外敷、口服、粘膜、鼻 内、皮下、雾化、静脉内、支气管、肺、阴道、外阴阴道、食管、或者□腔食管施用。
101. 权利要求98-100任一项的药物组合物，其配制为用于单一剂量施用。
102. 权利要求98-100任一项的药物组合物，其配制为用于多剂量施用。
103. 权利要求98-102任一项的药物组合物，其是持续释放配制物。
104. 治疗对象中应答抗-EGFR抗体治疗的病症的方法，包括给对象施用药物有效量的 权利要求98-103任一项的药物组合物。
105. 权利要求104的方法，其中所述应答抗-EGFR抗体治疗的病症是肿瘤、癌症或者转 移。
106. 权利要求105的方法，其中所述肿瘤表达EGFR。
107. 权利要求105或106的方法，其中所述肿瘤是实体肿瘤。
108. 权利要求104-107任一项的方法，其中应答抗-EGFR抗体治疗的病症是头颈癌、非 小细胞肺癌或者结肠直肠癌。
109. 权利要求104-108的方法，其中所述对象患有不包含赋予抗-EGFR治疗抗性的标 记的肿瘤。
110. 权利要求109的方法，其中所述标记是KRAS、NRAS或BRAF中的突变。
111. 权利要求104-108任一项的方法，其中所述对象患有表达KRAS突变-阴性的表皮 生长因子受体（EGFR)的结肠直肠癌。
112. 权利要求104-111任一项的方法，其中所述对象是哺乳动物。
113. 权利要求104-112任一项的方法，其中所述对象是人。
114. 权利要求104-113任一项的方法，其中所述药物组合物是外敷、肠道外、局部或全 身施用的。
115. 权利要求104-114任一项的方法，其中所述药物组合物是经鼻内、肌肉内、皮内、 腹膜内、静脉内、皮下、口服或者通过肺部施用的。
116. 权利要求104-115任一项的方法，其进一步包括施用一或多种抗癌剂或治疗。
117. 权利要求116的方法，其中所述抗癌剂或治疗选自伊立替康、奥沙利钼、5-氟尿嘧 啶（5-FU)、希罗达、坎普土沙、乐沙定、阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺钼、吉西他滨、卡钼和 辐射。
118. 权利要求104-117任一项的方法，其进一步包括施用一或多种另外的抗-EGFR抗 体或其抗原结合片段。
119. 权利要求118的方法，其中所述一或多种另外的抗-EGFR抗体选自西妥昔单抗、帕 尼单抗、尼妥珠单抗及其抗原结合片段。
120. 权利要求116-119任一项的方法，其中所述药物组合物和抗癌剂配制为单一组合 物或者分开的组合物。
121. 权利要求116-120任一项的方法，其中所述药物组合物和抗癌剂是相继、同时或 者间歇施用的。
122. 权利要求104-121任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的施用剂量大 约为或为 〇?lmg/kg_100mg/kg、0. 5mg/kg_50mg/kg、5mg/kg_50mg/kg、lmg/kg_20mg/kg、lmg/ kg-100mg/kg、10mg/kg-80mg/kg或者 50mg/kg-100mg/kg。
123. 权利要求104-122任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的施用剂量大 约为或为 〇? 〇lmg/m2-800mg/m2。
124. 权利要求104-123任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的施用剂量至 少为或至少大约为或大约为或为 〇? 01mg/m2、0.lmg/m2、0. 5mg/m2、lmg/m2、5mg/m2、10mg/m2、 15mg/m2、20mg/m2、25mg/m2、30mg/m2、35mg/m2、40mg/m2、45mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、150mg/ m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、600mg/m2 或者 700mg/m2。
125. 权利要求89-103任一项的药物组合物，其配制为用于治疗在对象中应答抗-EGFR 抗体治疗的病症的药物。
126. 权利要求89-103任一项的药物组合物在治疗在对象中应答抗-EGFR抗体治疗的 病症中的用途。
127. 权利要求125的药物组合物或者权利要求126的用途，其中应答抗-EGFR抗体治 疗的病症是肿瘤、癌症或转移。
128. 权利要求127的药物组合物或用途，其中所述肿瘤表达EGFR。
129. 权利要求127或128的药物组合物或应用，其中所述肿瘤是实体肿瘤。
130. 权利要求126-129任一项的药物组合物或应用，其中应答抗-EGFR抗体治疗的病 症是头颈癌、非小细胞肺癌或者结肠直肠癌。
【文档编号】G01N33/53GK104379602SQ201380024291
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年3月8日 优先权日:2012年3月8日
【发明者】G·卫, G·弗罗斯特, L·黄, H·M·谢泼德, D·E·沃恩 申请人:哈洛齐梅公司