一种快速检测Boule蛋白的胶体金试剂条及检测方法
【专利摘要】本发明为一种快速检测Boule蛋白的胶体金试剂条，在胶板上按照样品流动方向设有端头依次相接的样品垫、金标垫、层析膜以及吸水垫，层析膜上设有检测T区和质控C区；样品为待检测睾丸组织裂解液的上清液，金标垫上吸附有胶体金-抗Boule蛋白多克隆抗体-1结合物，检测T区包被抗Boule蛋白多克隆抗体-2，质控C区包被抗兔IgG。检测方法：1、取待检测睾丸组织裂解液的上清液；2、室温下，在样品垫上滴加待检测睾丸组织裂解液的上清液2-3滴；3、在5min内观察结果。本发明试剂条采用双抗体夹心法及免疫层析法技术检测睾丸组织裂解液中Boule蛋白的存在。检测过程敏感性好、特异性与准确性高，一次性明确精子发育阻滞情况，检测速度快，在5min内便可得到结果，操作简单。
【专利说明】一种快速检测Boule蛋白的胶体金试剂条及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胶体金试剂条及检测方法，特别是一种用于快速检测Boule蛋白的胶体金试剂条及检测方法。
【背景技术】
[0002]我国目前正面临着日益严重的不孕不育问题，调查显示国内10%的已婚家庭深受不孕不育的困扰，且比例逐年上升。50%的不孕不育是由男性不育因素所致，环境问题、机体代谢异常和遗传缺陷等均可导致男性不育。根深蒂固的传宗接代观念给男性不育患者带来了极大的精神负担。男性不育问题不仅威胁到家庭生活的各个层面，也影响到了整个社会的和谐，成为社会的不稳定因素，提高男性不育的诊治率已迫在眉睫。
[0003]随着辅助生殖这一医疗技术手段的蓬勃发展，通过人工授精、体外授精-胚胎移植、卵泡浆内单精子显微注射等技术方法，可产生单倍体精子的男性不育患者有了获得自己后代的可能。然而，目前临床上对于明确男性不育患者的精子阻滞情况、选取合适的用于辅助生殖的单倍体精子缺乏高效准确的检测手段，主要依赖睾丸反复穿刺取组织进行镜下观察并选取单倍体精子的方法。由于睾丸组织中精子发生的时相和分布不同，被检区可能能够产生单倍体精子，但尚未发育成熟，未能被观察到；被检区也可能能够产生单倍体精子，但受切片截面的影响，不能精确判断。因此该法准确性低，易产生假阴性结果，需要依靠对患者睾丸多个不同部位的反复多次活检来提高检测准确率，如患者确为单倍体精子不能形成，反复活检穿刺则毫无意义，且对患者具有较大的创伤性。
[0004]经过分子生物学等研究手段的分析和比对，证实Boule基因是目前已知最古老的精子发生所必需的基因。首先在小鼠中证实Boule基因缺失将导致雄性不育，精子发生阻滞在圆形精子阶段。进一步地，在针对临床22例病例的研究中证实人Boule基因缺失后不能产生正常精子，即使是体外授精时单细胞核注射所需的单倍体精子也无法产生。也就是说，人Boule基因缺失的患者无法依靠自身精子授孕。因此，Boule基因可作为检测不育男性患者能否产生供不育治疗所用精子的良好靶标。但是，目前还不具有对Boule基因快速有效地检测手段。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提出一种胶体金试剂条，能够快速、灵敏检测Boule蛋白的存在，明确精子发育的阻滞情况，预测取精的成功率。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种快速检测Boule蛋白的胶体金试剂条，在胶板上按照样品流动方向设有端头依次相接的样品垫、金标垫、层析膜以及吸水垫，层析膜上设有检测T区和质控C区；其中，样品为待检测睾丸组织裂解液的上清液，金标垫上吸附有胶体金-抗Boule蛋白多克隆抗体-1结合物，检测T区包被抗Boule蛋白多克隆抗体_2，质控C区包被抗兔IgG。
[0007]一种快速检测Boule基因的胶体金试剂条的检测方法，具体步骤如下:[0008]1、取待检测睾丸组织裂解液的上清液；
[0009]2、室温下，在样品垫上滴加待检测睾丸组织裂解液的上清液2-3滴；
[0010]3、在5min内观察结果。
[0011]进一步，所述待检测睾丸组织裂解液的上清液中存在Boule蛋白的浓度高于检测水平7.8pg / ml时，在检测T区和质控C区各出现一条红色带，结果为阳性。
[0012]进一步，所述待检测睾丸组织裂解液的上清液中存在Boule蛋白的浓度低于检测水平7.8pg / ml时，仅在质控C区出现一条色带，结果为阴性。
[0013]进一步，所述检测T区和质控C区均不出现色带，结果为无效。
[0014]进一步，所述睾丸组织裂解液冷藏温度为2_8°C，保存时间为48小时。
[0015]进一步，所述睾丸组织裂解液冷冻温度为-20°C。
[0016]本发明的有益效果在于，试剂条采用双抗体夹心法及免疫层析法技术检测睾丸组织裂解液中Boule蛋白的存在。检测过程敏感性好、特异性与准确性高，一次性明确精子发育阻滞情况，无需反复多次取活检。此外，本发明检测速度快，在5min内便可得到结果，操作简单。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明所述检测Boule蛋白的胶体金试剂条的结构示意图；
[0018]图2为采用Western Blot显示Boule蛋白的条带图。
[0019]图中:1、样品垫，2、金标垫，3、检测T区，4、质控C区，5、吸水垫，6、层析膜，7、胶板。【具体实施方式】
[0020]为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0021]如图1所示，一种快速检测Boule基因的胶体金试剂条，在胶板7上按照样品流动方向设有端头依次相接的样品垫1、金标垫2、层析膜6以及吸水垫5，层析膜6上设有检测T区3和质控C区4 ;其中，样品为待检测睾丸组织裂解液的上清液，金标垫2上含有胶体金-抗Boule蛋白多克隆抗体-1结合物，检测T区3包被抗Boule蛋白多克隆抗体_2，质控C区4包被抗兔IgG。金标垫2为玻璃纤维膜，玻璃纤维膜上吸附的胶体金颗粒系由氯金酸在还原剂作用下聚合形成的。胶体金颗粒与抗Boule蛋白多克隆抗体-1结合形成胶体金-抗Boule蛋白多克隆抗体-1结合物。层析膜6为硝酸纤维膜。
[0022]抗Boule蛋白多克隆抗体的制备过程为:
[0023]1、抗Boule蛋白多克隆抗体是通过构建带有Boule氨端、全长编码区的Boule的GEX4T1表达载体，转化BL21细胞，诱导细菌表达GST标签和氨基端Boule重组蛋白(1-168氨基酸)，这段肽段包含最保守的RNA结合功能区；
[0024]2、带有GST标签的重组蛋白通过镍柱亲和层析法纯化后，SDS电泳检测纯度大于90% ；
[0025]3、经过 3 次免疫实验兔子，ELISA (enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附剂测定)抗体滴度达到1: 108，一般大于IO5可用，收集血清备检测。
[0026]抗Boule蛋白多克隆抗体的特异性检测:[0027]如图2所示，采用Western Blot (蛋白印迹方法)显示约37KD和45KD处出现特异性条带，条带位置提示的蛋白分子量与理论分子量吻合。运用Western Blot (蛋白印迹方法)，在1: 1000的稀释度可以明确地在人睾丸组织中检测到预计大小的Boule蛋白。由于Boule蛋白的高度保守性,该抗体也可检测到小鼠Boule蛋白，而在Boule基因敲除的小鼠睾丸中则检测不到，证明该抗体的特异性。
[0028]上述快速检测Boule蛋白的胶体金试剂条的检测方法，具体步骤如下:
[0029]1、取待检测睾丸组织裂解液的上清液。具体为:取未见成熟精子的睾丸穿刺组织制备组织裂解液，加入裂解液后超声离心，取上清液检测。
[0030]2、室温下，在样品垫上滴加待检测睾丸组织裂解液的上清液2-3滴。需要说明的是，被检样品、试剂条及其他所用器材均在室温平衡，在试纸卡上标明被检样品或对照品。
[0031]3、在5min内观察结果。
[0032]结果的判定:
[0033]阳性:如样本中存在Boule蛋白的浓度高于检测水平7.8pg / ml时，胶体金-抗Boule蛋白多克隆抗体-1结合物与层析膜结合，在检测T区和质控C区各出现一条红色带。
[0034]阴性:如样本中存在Boule蛋白的浓度低于检测水平7.8pg / ml时，仅在质控C区出现一条色带。
[0035]无效:在检测T区和质控C区均不出现色带，表示检测无效。当检测无效时，需要重新测试。
[0036]质控C区内所显现的红色条带是判定是否有样品足够量、层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。Boule蛋白浓度很高时，检测C区很明显，而对照T区变得很弱，为正常结果。
[0037]需要说明的是，对于待检测的睾丸组织裂解液，必须收集在洁净、干燥不含有任何防腐剂的容器内。裂解液若呈可见的混浊或有颗粒沉淀，需先离心、过滤或待其沉淀后取上清液检测。若不能及时检测，组织裂解液应当于2_8°C冷藏保存48小时。长期保存需冷冻于-20°C，忌反复冻融。
【权利要求】
1.一种快速检测Boule蛋白的胶体金试剂条，在胶板上按照样品流动方向设有端头依次相接的样品垫、金标垫、层析膜以及吸水垫，层析膜上设有检测T区和质控C区；其特征在于:样品为待检测睾丸组织裂解液的上清液，金标垫上吸附有胶体金-抗Boule蛋白多克隆抗体-1结合物，检测T区包被抗Boule蛋白多克隆抗体_2，质控C区包被抗兔IgG。
2.如权利要求1所述的一种快速检测Boule基因的胶体金试剂条的检测方法，具体步骤如下: 步骤1.取待检测睾丸组织裂解液的上清液； 步骤2.室温下，在样品垫上滴加待检测睾丸组织裂解液的上清液2-3滴； 步骤3.在5min内观察结果。
3.如权利要求2所述的一种快速检测Boule基因的胶体金试剂条的检测方法，其特征在于:所述待检测睾丸组织裂解液的上清液中存在Boule蛋白的浓度高于检测水平7.8pg / ml时，在检测T区和质控C区各出现一条红色带，结果为阳性。
4.如权利要求3所述的一种快速检测Boule基因的胶体金试剂条的检测方法，其特征在于:所述待检测睾丸组织裂解液的上清液中存在Boule蛋白的浓度低于检测水平7.8pg / ml时,仅在质控C区出现一条色带,结果为阴性。
5.如权利要求3所述的一种快速检测Boule基因的胶体金试剂条的检测方法，其特征在于:所述检测T区和质控C区均不出现色带，结果为无效。
6.如权利要求3所述的一种快速检测Boule基因的胶体金试剂条的检测方法，其特征在于:所述睾丸组织裂解液冷藏温度为2-8°C，保存时间为48小时。
7.如权利要求3所述的一种快速检测Boule基因的胶体金试剂条的检测方法，其特征在于:所述睾丸组织裂解液冷冻温度为_20°C。
【文档编号】G01N33/68GK103852583SQ201410110639
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】徐宇君, 晏媛, 杨健 申请人:南京医科大学