用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒及其用途。本发明所述试剂盒中包含由保藏号CGMCC?NO.9106以及保藏号为CGMCC?NO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体，其中任选一种单克隆抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。本发明发明人制备并筛选得到的两株杂交瘤细胞株能够识别马传染性贫血病毒p26蛋白不同抗原表位，且实验证明该两株杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体只与马传染性贫血病毒而不与其他马源病毒反应，使用本发明的方法检测马传染性贫血病毒p26蛋白抗原，其最低检测下限为98pg。本发明为马传染性贫血病毒的检测提供了一种有效的，准确性高的新的检测手段，同时为马传染性贫血病毒的防治提供了技术支撑。
【专利说明】用于检测马传染性贫血病毒P26蛋白的试剂盒及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种病毒抗原检测试剂盒及其用途，特别涉及一种用于检测马传染性贫血病毒P26蛋白的试剂盒及其用途，本发明属于病毒感染的诊断及检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]马传染性贫血病毒(EIAV)是反录病毒科(Retroviridae)慢病毒属的成员，可引起马、骡、驴的传染性贫血病，以发热、贫血、出血、黄疸、浮肿、心机能紊乱、血相变化和进行性消瘦为特征。根据临诊表现，常分为急性、亚急性、慢性和隐性4种病型，除有主要症状如发烧、贫血、黄疸、出血、心机能紊乱外，血液学的变化也很突出，如红细胞数减少、血红蛋白量降低、白细胞数常减少和静脉血中出现吞铁细胞等。该病呈世界分布，给养马业造成巨大经济损失。此外也曾有几例人感染此病毒的报道。发烧期的病马是最危险的传染源，其血液和脏器(肝、脾、骨髓、淋巴结等)含有大量病毒，常随同分泌物和排泄物排出体外而散播。慢性病马能长期甚至终身带毒。
[0003]EIAV是正链RNA病毒，其基因组结构与其它慢病毒相似。病毒RNA编码三个主要结构基因gag、Po I和env，此外还有几个小开放阅读框架(0RF S1、S2、S3)，其中gag和pol基因部分重叠。病毒RNA基因组两端是完全相同的重复区(R区)，在5’R下游是5’独特区(US) ;3’端R区上游是3’独特区(U3)。EIAvGag前体蛋白为分子量为55KD的Pr55，Pr55经病毒编码的蛋白酶裂解产生四种主要的结构蛋白。分别为基质蛋白MP15、衣壳蛋白CA/P26、核衣壳蛋白NC/P11及核心蛋白p9。基质蛋白MA、衣壳蛋白CA、核衣壳蛋白NC是构成病毒粒子的主要蛋白，尤其是P26，可以占病毒蛋白总量的40%，在病毒装配和出芽过程中发挥重要作用。由于P26蛋白非常保守，任何不同血清型的马传贫病毒感染马都能产生对P26抗原的抗体，因此P26蛋白是马传贫免疫琼脂扩散(AGID)和ELISA诊断法使用的主要抗原。
[0004]马传贫的流行病毒调查主要以血清学检测为主，然而血清抗体的产生往往滞后于病毒感染，因此，血清学检测抗体会有漏检的情况出现。目前，针对EIAV抗原检测的方法主要有RT-PCR方法、ELISA方法以及传统的病毒分离鉴定等，病毒分离耗时费力，荧光定量RT-PCR使用Taq探针法价格昂贵，相比之下，ELISA方法最为简便快捷、成本低又敏感性高、特异性好。然而利用ELISA方法检测EIAV病毒的报道并不多见，国际上也没有检测马传贫病毒的商品化试剂盒。目前多采用商品化的反转录酶试剂盒检测和定量EIAV病毒，但是该试剂盒中应用HIV的反转录酶作为标准品，因此在定量和检测EIAV时的准确性并不十分理想，而且该试剂盒价格昂贵，不适合于大批量临床样品的检测。因此，建立一种快速、敏感、可靠的方法检测EIAV病毒，形成可应用于实际临床样本检测的ELISA商品化试剂盒是十分必要和亟待解决的。
[0005]该检测方法的应用对及时控制疾病传播和蔓延，最大限度的减少马传贫对养马业造成的损失具有重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒及其用途。
[0007]为此，本发明发明人制备并筛选出了两株能够识别马传染性贫血病毒p26蛋白不同抗原表位的杂交瘤细胞株，特异性实验证明由该两株杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体只与马传染性贫血病毒而不与I型马疱疫病毒，IV型马疱疫病毒，马流感病毒以及马动脉炎病毒反应，说明本发明的方法特异性好。此外，灵敏度实验证明使用本发明的方法检测马传染性贫血病毒P26蛋白抗原，其敏感性为98pg。因此，本发明为马传染性贫血病毒的检测提供了一种有效的，准确性高的新的检测手段。
[0008]具体的，本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的:
[0009]本发明的一种用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含由保藏号CGMCC N0.9106以及保藏号为CGMCC N0.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体，任选其中一种单克隆抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。
[0010]其中，保藏号为CGMCCN0.9106的杂交瘤细胞株，命名为EIAV-p26-lGll，分类命名为单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，保藏日期为2014年4月21日。
[0011]其中，保藏号为CGMCC N0.9107的杂交瘤细胞株，命名为EIAV-p26_9H8，分类命名为单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，保藏日期为2014年4月21日。
[0012]在本发明中，优选的，保藏号CGMCC N0.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。
[0013]更优选的，保藏号CGMCC N0.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体是用辣根过氧化物酶标记的。
[0014]在本发明中，优选的，所述试剂盒还进一步包含阳性参考品、稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
[0015]在本发明中，优选的，所述的阳性参考品为纯化的马传染性贫血病毒p26蛋白，所述的稀释液为含有10% (v/v)小牛血清(CS)以及0.1% (v/v)TRITON X-100的磷酸盐缓冲液，所述的封闭液为含有5% (v/v)小牛血清的磷酸盐缓冲液，所述的洗涤液为PBST缓冲液，所述的显色液的TMB A+B双组分显色液，所述的终止液为2M H2S04。
[0016]在本发明中，优选的，所述的试剂盒是通过以下步骤检测马传染性贫血病毒p26蛋白:
[0017](I)用稀释液将保藏号为CGMCC N0.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体稀释至I μ g/ml，加至96孔板，每孔100 μ I，4°C过夜，所述的稀释液为含有10%小牛血清以及0.1% TRITON X-100的磷酸盐缓冲液；
[0018](2) PBST缓冲液洗4次，前3次Imin,第4次5min ；
[0019](3)用含有5%小牛血清的磷酸盐缓冲液封闭，每孔200μ 1，37°C封闭Ih ；
[0020](4) PBST缓冲液洗4次，前3次Imin,第4次5min ；
[0021](5)加入稀释后的待检测抗原，每孔100 μ 1，37°C孵育2h ；[0022](6) PBST缓冲液洗4次，前3次Imin,第4次5min ；
[0023](7)用稀释液稀释HRP标记的保藏号CGMCC N0.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体，加入稀释后的酶标抗体，每孔100μ 1，37°C孵育2h ；
[0024](8) PBST缓冲液洗4次，前3次Imin,第4次5min ；
[0025](9)加入TMB A+B双组分显色液，每孔100 μ 1，室温避光静止IOmin ；
[0026](10)加入2Μ H2SO4终止反应，立即于OD45tlnm测值。
[0027]进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的试剂盒在制备检测马传染性贫血病毒Ρ26蛋白以及在制备检测马传染性贫血病毒的试剂中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为两株单克隆抗体进行间接免疫荧光实验的结果；
[0029]图2为ρ26基因的序列的分段表达；
[0030]图3为单抗IGll以及9Η8与ρ26基因不同区段的Western blotting结果；
[0031]图4为特异性实验结果图；
[0032]图5为AC-ELISA检测的线性范围确定；
[0033]图6为AC-ELISA检测2倍梯度稀释的EIAVcmv3_8p26蛋白的浓度与对应的0D450值绘制线性图；
[0034]图7为采用本发明的AC-ELISA方法与其他方法进行检测的比较结果。
【具体实施方式】
[0035]下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0036]实施例1单克隆抗体Mab的制备和纯化
[0037]1、仪器和试剂:
[0038]CO2 培养箱(Heal Force, Hong Kong);水浴锅(一恒，China)；倒置显微镜(Nikon, Japan);离心机(Thermo Scientific, United States);液体石腊(国产)；
[0039]BALB/C 小鼠(实验动物中心提供)；1640 培养液(HyClone, United States)；FBS (Gibco, United States)；电泳仪(Bio Rad, United States)；浓度测定仪(ThermoScientific, United States) ;BCA (Novagen, Germany) ； 10mT,注射器(康寿,China)；5OmL 离心管(corning) ;0.45μηι 滤膜(Millipore, United States) ；HiTrap ProteinG(IOmL) (GE, United States) ；Binding Buffer: 20mM sodium phosphate (恒兴,China),pH7.0Elution Buffer:0.1M glycine-HCl (KH, 0167)，pH9.0。
[0040]2、杂交瘤细胞的筛选
[0041]以纯化后的原核表达的重组天然p26蛋白免疫5只6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，一免将重组p26蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，二免和三免将重组p26蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，免疫剂量为50 μ g/只，免疫途径为腹腔免疫。分别在二免和三免后一周对小鼠进行断尾采血，分离血清(4°C离心，3000g, IOmin),用间接ELISA检测抗体水平。在细胞融合前3天，对免疫效果好的BALB/c小鼠再进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射50 μ g免疫抗原(不加佐剂)。[0042]融合前一天准备饲养层细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞4:1的比例用PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准好的饲养层细胞之上。
[0043]利用纯化后的原核表达p26蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆，克隆3轮，将克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。
[0044]最终获得两株可以稳定分泌抗p26蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为EIAV-p26-lGll以及EIAV-p26_9H8，其中，EIAV_p26_lGll保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，保藏号为CGMCC N0.9106，保藏日期为2014年4月21日。EIAV-p26_9H8保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，保藏号为CGMCC N0.9107，保藏日期为2014年4月21日。
[0045]3、单克隆抗体的大量制备
[0046](I)将EIAV-p26-9H8杂交瘤细胞株于液氮罐取出，置于37°C水浴锅复苏。
[0047](2)加入1640培养液(20% FBS+1%双抗)至细胞培养瓶，放入37°C，5% C02培
养箱进行培养。
[0048](3)于细胞生长生长期收集细胞:先用移液器轻轻吹打使细胞脱落，1000rpm4°C离心lOmin，用1640(不含FBS和双抗)培养液重悬细胞。将重悬细胞置于倒置显微镜下进行计数，按照I X IOVcm2分装细胞。
[0049](4)对6-8周龄雌性BALB/C小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，7-10天后每只小鼠腹腔注射I X IO5个杂交瘤细胞，待一周后观察腹腔有明显膨大后抽取腹腔积液，分装至EP管中。
[0050](5)分装后的腹腔积液4°C，5000rpm离心lOmin，离心后取上清分装，_80°C保存，得到的单抗命名为EIAV-p26-9H8单克隆抗体(简称9H8)，_80°C冻存。
[0051]同样方法制备EIAV-p26-lGll (简称IGlI)单克隆抗体。
[0052]4、单克隆抗体的纯化(按照GE说明书进行)
[0053](I)将单克隆抗体于_80°C取出，在纯化前先用0.45 μ m滤膜过滤；
[0054](2)在每个收集管加入 60 μ IlM Tris-HCl (ρΗ9.0)；
[0055](3)将装有IOml Binding Buffer的注射器连接柱子顶端,打开柱子底部螺栓,推动注射器使Binding Buffer以lmL/min的速度流经柱子；
[0056](4)注射器吸入样品，同样使样品流经柱子，流速为0.2-lmL/min ；
[0057](5)用 5-10mL Binding Buffer 洗脱未结合的样品；
[0058](6)用2-5mL Elution Buffer洗脱在结合在柱子上的单克隆抗体；
[0059](7) SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析目的条带；
[0060](8) BCA法测定蛋白浓度；
[0061 ] (9)分装纯化样品，-80 0C保存。
[0062]5、单抗亚型鉴定(按照说明书进行)(Southern Biotech Associations, UnitedStates)
[0063]主要的步骤为:用试剂盒提供的捕获抗体包被ELISA板，封闭后加入待检单克隆抗体，并通过孵育HRP标记的检测抗体，最终在酶标仪上读取ELISA板。
[0064]结果:
[0065](I)单克隆抗体的验证
[0066]在293T细胞上，通过脂质体Lipo2000转染EIAV感染性克隆cmv3_8质粒，转染后48h，分别应用两株单克隆抗体进行间接免疫荧光实验，结果如图1所示，两株单抗均可以特异性的识别EIAV。
[0067](2)亚型鉴定
[0068]两株单克隆抗体经亚型鉴定,结果如表1所示:阳性对照孔(screening antibody)和阴性对照孔(NTC)的检测结果均与预期结果一致，经检测两株单抗均为K链，其中9H8单抗为IgG2a，IGll单抗为IgGl。
[0069]表1
[0070]
【权利要求】
1.一种用于检测马传染性贫血病毒P26蛋白的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含由保藏号为CGMCC N0.9106以及保藏号为CGMCC N0.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体，任选其中一种单克隆抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于保藏号CGMCCN0.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于保藏号CGMCCN0.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体是用辣根过氧化物酶标记的。
4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于还进一步包含阳性参考品、稀释液、封闭液、洗涤液、显色液和终止液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性参考品为纯化的马传染性贫血病毒P26蛋白，所述的稀释液为含有10%小牛血清以及0.1% TRITON X-100的磷酸盐缓冲液，所述的封闭液为含有5%小牛血清的磷酸盐缓冲液，所述的洗涤液为PBST缓冲液，所述的显色液的TMB A+B双组分显色液，所述的终止液为2M H2S04。
6.如权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于是通过以下步骤检测马传染性贫血病毒p26蛋白: (1)用稀释液将保 藏号为CGMCCN0.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体稀释至I μ g/ml,加至96孔板,每孔100 μ 1,4°C过夜,所述的稀释液为含有10%小牛血清以及0.1% TRITON x-100的磷酸盐缓冲液； (2)PBST缓冲液洗4次，前3次Imin,第4次5min ； (3)用含5%小牛血清的磷酸盐缓冲液封闭，每孔200μ1，37°C封闭Ih ； (4)PBST缓冲液洗4次，前3次Imin,第4次5min ； (5)加入稀释后的待检测抗原，每孔IOOy1，37°C孵育2h ； (6)PBST缓冲液洗4次，前3次Imin,第4次5min ； (7)用稀释液稀释HRP标记的保藏号CGMCCN0.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体，加入稀释后的酶标抗体，每孔100μ 1，37°C孵育2h ； (8)PBST缓冲液洗4次，前3次Imin,第4次5min ； (9)加入TMBA+B双组分显色液，每孔100 μ 1，室温避光静止IOmin ； (10)加入2ΜH2SO4终止反应，立即于OD45tol测值。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在制备检测马传染性贫血病毒ρ26蛋白的试剂中的应用。
8.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在制备检测马传染性贫血病毒的试剂中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK104020294SQ201410239152
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】王晓钧, 胡哲, 林跃智, 周建华 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所