一种绿色荧光碳点的制备方法及在细胞成像方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种绿色荧光碳点的制备方法及在细胞成像方面的应用，属于荧光纳米材料的制备和应用领域。本发明具体的制备步骤如下：(1)将花瓣粉末加入去离子水中，制得混合液；(2)将(1)得到的混合液转移到水热反应釜中，进行水热反应；(3)将(2)得到的产物经过离心、透析，最终得到绿色荧光碳点溶液。本发明将植物花瓣作为碳源，原料广泛易得，制备方法简单，成本低；而且制得的绿色荧光碳点水溶性好、稳定性强，可直接用于细胞成像等。
【专利说明】一种绿色荧光碳点的制备方法及在细胞成像方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及荧光纳米材料的制备，具体属于一种绿色荧光碳点的制备方法及在细胞成像方面的应用。
【背景技术】
[0002]碳纳米点，也称为碳点，是一类尺寸小于1nm的新型碳纳米材料,于2004年通过电泳法净化单层碳纳米管时首次发现。由于其稳定性强、毒性小、水溶性好、成本低和原材料丰富等优点，碳点逐渐成为碳纳米材料家族中的一颗新星，并广泛应用于生物成像、荧光打印、传感等研究领域。
[0003]目前，大多数合成的荧光碳点在紫外光激发下发射蓝光。在生物成像方面，绿色荧光碳点更有吸引力，这是由于生物的自体荧光一般为蓝色，将绿色荧光碳点用于生物标记，则会避免生物自体荧光的干扰。
[0004]现有的绿色荧光碳点的制备方法分为“自上而下”和“自下而上”两类。
[0005]文献(Doped Carbon Nanoparticles as a New Platform for HighlyPhotoluminescent Dots,Yaping Sun,Xin Wang, Fushen Lu，Li Cao，MohammedJ.Mezianij Pengju G.Luoj Lingrong Gu，and L.Monica Vecaj J.Phys.Chem.C, 2008, 112，18295 - 18298)，利用激光烧蚀法制得碳纳米颗粒，并在碳核上掺杂氧化锌或硫化锌，从而得到绿色突光碳点；文献(Graphitized carbon dots emittingstrong green photoluminescence, Yun Liu, Chunyan Liu, and Zhiying Zhang, J.Mater.Chem.C, 2013, I, 4902 - 4907)，利用乙二醇在浓硫酸作用下，通过一步微波法合成具有绿色突光的石墨烯量子点；文献(Water-soluble and phosphorus-containingcarbon dots with strong green fluorescence for cell labeling,WeiWang, Yongmao Li,Lu Cheng, Zhiqiang Cao, and Wenguang Liu, J.Mater.Chem.B，2014，2，46 - 48)，利用植酸和乙二胺通过微波法合成绿色荧光碳点；文献(One-st印microwave-assisted polyol synthesis of green luminescent carbon dots as opticalnanoprobes, Yi Liu, Ning Xiao, Ningqiang Gong, Hao Wang, Xin Shi, Wei Gu, and LingYe, Carbon, 2014，68，258 - 264)，以糖类为碳源，以二甘醇为反应介质，通过一步微波法合成绿色突光碳点° 文献(Fast, energy-efficient synthesis of luminescent carbonquantum dots, Yongsheng Li, Xiaoxia Zhong, Amanda E.Rider, Scott A.Furmand, andKostya (Ken) Ostrikov, Green Chem., 2014, 16, 2566 - 2570)，利用糖类和喊合成绿色突光碳点。自上而下的合成方法实验条件苛刻，制备方法复杂；自下而上的合成方法大多使用了化学试剂，对环境具有一定的危害。
[0006]因此，研究简单、绿色的绿色荧光碳点的制备方法，对于荧光纳米材料在生物成像、荧光打印、传感等方面的应用有重要的意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种制备绿色荧光碳点的方法。
[0008]本发明的另一目的在于将所制备的绿色荧光碳点应用于细胞成像。
[0009]为实现上述目的，本发明提供的一种制备绿色荧光碳点的方法，是以花瓣为碳源，去离子水为溶剂，通过一步水热法制得。
[0010]进一步，本发明提供的一种制备绿色荧光碳点的方法，包括如下步骤:
[0011](I)将花瓣粉末加入去离子水中，制得混合液；
[0012](2)将(I)得到的混合液转移到水热反应釜中，进行水热反应；
[0013](3)将⑵得到的产物经过离心、透析，最终得到绿色荧光碳点溶液。
[0014]步骤⑴中所述的花瓣粉末与去离子水按质量比1:10?100混合。
[0015]步骤⑵中所述的水热反应的温度为150?300°C，持续2?4h。
[0016]步骤(3)中所述的离心是以4000r/min转速离心1min,所述的透析是用截留分子量为500?100Da的透析袋透析48h。
[0017]所述的花瓣粉末，是将新鲜花瓣烘干研磨成粉末状。所述的花瓣是各种植物的花瓣。
[0018]上述方法制备的绿色荧光碳点具有良好的绿色发光性能，可在细胞成像方面应用。
[0019]本发明的优点在于:
[0020](I)以花瓣为碳源，原料广泛易得，绿色环保，制备方法简单，成本低廉；
[0021](2)制得的绿色荧光碳点具有良好的绿色发光性能，将其用于生物标记，可以避免生物自体荧光的干扰。
[0022](3)制得的绿色荧光碳点稳定性强、毒副作用小、水溶性好，在生物成像、荧光打印、传感等领域有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明实施例1制备的绿色荧光碳点溶液分别在日光灯和波长为365nm紫外灯照射下的照片
[0024]图2为本发明实施例1制备的绿色荧光碳点在透射电子显微镜(TEM)下的照片
[0025]图3为本发明实施例1制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图
[0026]图4为本发明实施例2制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图
[0027]图5为本发明实施例3制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图
[0028]图6为本发明实施例4制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图
[0029]图7为本发明实施例5制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图
[0030]图8为本发明实施例6制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图
[0031]图9为本发明实施例7制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图
[0032]图10为本发明实施例8制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图
[0033]图11为本发明实施例9制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图
[0034]图12为本发明实施例10中pH值对绿色荧光碳点的荧光强度的影响
[0035]图13为本发明实施例11中金属离子对绿色荧光碳点的荧光强度的影响
[0036]图14为本发明实施例12中绿色荧光碳点在人子宫颈鳞状细胞癌细胞(A193)中的荧光成像(1:细胞明场照片，2:碳点标记细胞荧光成像(激发波长为488nm)，3:明场和荧光像叠加照片)
【具体实施方式】
[0037]本发明是以花瓣为碳源，以去离子水为溶剂，通过一步水热法制备绿色荧光碳点并将其应用于细胞成像方面。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0038]实施例1
[0039]以百合花瓣为碳源的绿色荧光碳点的制备:
[0040](I)将0.5g百合花瓣粉末加入20mL去离子水中，制得混合液；
[0041](2)将(I)得到的混合液转移到水热反应釜中，在200°C下水热反应3h ；
[0042](3)将⑵得到的产物用离心机以4000r/min转速离心lOmin，再用截留分子量为500?100Da的透析袋透析48h，最终得到绿色荧光碳点溶液。
[0043]制备的绿色荧光碳点溶液分别在日光灯和波长为365nm紫外灯照射下的照片见图1，其中I为绿色荧光碳点溶液在日光灯照射下的图片，颜色为棕色，2为波长为365nm紫外灯照射下的图片，颜色为绿色。
[0044]制备的绿色荧光碳点在透射电子显微镜(TEM)下的照片见图2。
[0045]制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图见图3，其中I?7分别是激发波长为400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm和460nm激发下的突光光谱图。
[0046]实施例2
[0047]以月季花瓣为碳源的绿色荧光碳点的制备:
[0048](I)将0.5g月季花瓣粉末加入20mL去离子水中，制得混合液；
[0049](2)将⑴得到的混合液转移到水热反应釜中，在250°C下水热反应2h ；
[0050](3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心1min,再用截留分子量为500?100Da的透析袋透析48h，最终得到绿色荧光碳点溶液。
[0051]制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图见图4，其中I?7分别是激发波长为400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm和460nm激发下的突光光谱图。
[0052]实施例3
[0053]以槐花花瓣为碳源的绿色荧光碳点的制备:
[0054](I)将0.5g槐花花瓣粉末加入30mL去离子水中，制得混合液；
[0055](2)将(I)得到的混合液转移到水热反应釜中，在200°C下水热反应3h ；
[0056](3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心1min,再用截留分子量为500?100Da的透析袋透析48h，最终得到绿色荧光碳点溶液。
[0057]制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图见图5，其中I?7分别是激发波长为400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm和460nm激发下的突光光谱图。
[0058]实施例4
[0059]以映山红花瓣为碳源的绿色荧光碳点的制备:
[0060](I)将0.5g映山红花瓣粉末加入40mL去离子水中，制得混合液；
[0061](2)将(I)得到的混合液转移到水热反应釜中，在250°C下水热反应3h ；
[0062](3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心lOmin，再用截留分子量为500?100Da的透析袋透析48h，最终得到绿色荧光碳点溶液。
[0063]制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图见图6，其中I?5分别是激发波长为400nm、410nm、420nm、430nm和440nm激发下的荧光光谱图。
[0064]实施例5
[0065]以龙牙花瓣为碳源的绿色荧光碳点的制备:
[0066](I)将0.5g龙牙花瓣粉末加入50mL去离子水中，制得混合液；
[0067](2)将(I)得到的混合液转移到水热反应釜中，在300°C下水热反应2h ；
[0068](3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心1min,再用截留分子量为500?100Da的透析袋透析48h，最终得到绿色荧光碳点溶液。
[0069]制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图见图7，其中I?7分别是激发波长为400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm和460nm激发下的突光光谱图。
[0070]实施例6
[0071]以白玉兰花瓣为碳源的绿色荧光碳点的制备:
[0072](I)将0.5g白玉兰花瓣粉末加入20mL去离子水中，制得混合液；
[0073](2)将⑴得到的混合液转移到水热反应釜中，在250°C下水热反应3h ；
[0074](3)将⑵得到的产物用离心机以4000r/min转速离心1min,再用截留分子量为500?100Da的透析袋透析48h，最终得到绿色荧光碳点溶液。
[0075]制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图见图8，其中I?7分别是激发波长为400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm和460nm激发下的突光光谱图。
[0076]实施例7
[0077]以黄刺梅花瓣为碳源的绿色荧光碳点的制备:
[0078](I)将0.5g黄刺梅花瓣粉末加入30mL去离子水中，制得混合液；
[0079](2)将⑴得到的混合液转移到水热反应釜中，在250°C下水热反应2h ；
[0080](3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心1min,再用截留分子量为500?100Da的透析袋透析48h，最终得到绿色荧光碳点溶液。
[0081]制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图见图9，其中I?6分别是激发波长为400nm、410nm、420nm、430nm、440nm和450nm激发下的突光光谱图。
[0082]实施例8
[0083]以蜀葵花瓣为碳源的绿色荧光碳点的制备:
[0084](I)将0.5g蜀葵花瓣粉末加入40mL去离子水中，制得混合液；
[0085](2)将(I)得到的混合液转移到水热反应釜中，在300°C下水热反应3h ；
[0086](3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心1min,再用截留分子量为500?100Da的透析袋透析48h，最终得到绿色荧光碳点溶液。
[0087]制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图见图10，其中I?7分别是激发波长为400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm和460nm激发下的突光光谱图。
[0088]实施例9
[0089]以牵牛花花瓣为碳源的绿色荧光碳点的制备:
[0090](I)将0.5g牵牛花花瓣粉末加入50mL去离子水中，制得混合液；
[0091](2)将(I)得到的混合液转移到水热反应釜中，在250°C下水热反应4h ；
[0092](3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心lOmin，再用截留分子量为500?100Da的透析袋透析48h，最终得到绿色荧光碳点溶液。
[0093]制备的绿色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图见图11，其中I?7分别是激发波长为400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm和460nm激发下的突光光谱图。
[0094]实施例10
[0095]pH值对实施例1制备的绿色荧光碳点的荧光强度的影响实验:
[0096]分别将0.2mL实施例1制备的绿色荧光碳点溶液加入到2mL不同pH值的磷酸缓冲溶液中，固定激发波长为440nm，在20°C下进行荧光光谱检测，根据520nm处的荧光强度，检测PH值对绿色荧光碳点的荧光强度的影响。
[0097]pH值对绿色荧光碳点的荧光强度的影响见图12:在440nm激发下，绿色荧光碳点在pH为3-10的范围内，荧光峰强度基本保持不变，说明本发明制备的绿色荧光碳点可以应用于各种酸碱体系。
[0098]实施例11
[0099]金属离子对实施例1制备的绿色荧光碳点的荧光强度的影响实验:
[0100]用PH = 5 的 0.0lmol.Γ1 的磷酸缓冲液和 AgNO3' Al (NO3)3' Ba (NO3) 2、Bi (NO3)2'Ca(NO3)2' Cd(NO3)2' Co (NO3)2' Cu(NO3)2' Fe (NO3)2' Fe (NO3) 3、Hg(NO3)2' K(NO3)2' Mg(NO3)2'Mn (NO3) 2、NaN03、Ni (NO3) 2、Pb (NO3) 2、Zn (NO3) 2 分别配制金属离子浓度为 300 μ mo I.Γ1 的溶液，分别将0.2mL实施例1制备的绿色荧光碳点溶液加入到2mL上述含不同金属离子的溶液中，固定激发波长为440nm，在20°C下进行荧光光谱检测，根据520nm处的荧光强度，检测金属离子对绿色荧光碳点的荧光强度的影响。
[0101]金属离子对绿色荧光碳点的荧光强度的影响见图13:在440nm激发下，F与Ftl的比值基本不变(F和Ftl分别代表加入金属离子和未加金属离子的荧光强度值)，说明本发明制备的绿色荧光碳点具有良好的抗金属离子干扰性。
[0102]实施例12
[0103]实施例1制备的绿色荧光碳点在细胞成像方面的应用实验:
[0104](I)将人子宫颈鳞状细胞癌细胞(A193)接种于6孔板中，每孔加入封闭液，将其放入湿盒中，再放入37°C、5% CO2培养箱中孵育30min ；
[0105](2)取出6孔板，先用0.0lmol.Γ1的磷酸缓冲液洗去封闭液，再用滤纸将孔板周围液体吸干；
[0106](3)将实施例1制备的绿色荧光碳点加入6孔板中，在37°C、5% CO2培养箱中共孵育30min ；
[0107](4)用0.0lmol.Γ1的磷酸缓冲液洗涤，然后置于荧光显微镜下观察碳点与细胞标记情况。
[0108]绿色荧光碳点标记人子宫颈鳞状细胞癌细胞(A193)的荧光显微镜图见图14(1:细胞明场照片，2:碳点标记细胞荧光成像(激发波长为488nm)，3:明场和荧光像叠加照片):在荧光显微镜下观察细胞标记情况，可以看到细胞呈现出明亮的绿色荧光，说明本发明制备的绿色荧光碳点在细胞成像方面具有良好的应用。
【权利要求】
1.一种绿色荧光碳点的制备方法，其特征在于，绿色荧光碳点是以花瓣为碳源，去离子水为溶剂，通过一步水热法制得。
2.如权利要求1所述的一种绿色荧光碳点的制备方法，其主要步骤为: (1)将花瓣粉末加入去离子水中，制得混合液； (2)将(I)得到的混合液转移到水热反应釜中，进行水热反应； (3)将(2)得到的产物经过离心、透析，最终得到绿色荧光碳点溶液。
3.如权利要求2所述的一种绿色荧光碳点的制备方法，其特征在于，步骤(I)中所述的花瓣粉末与去离子水按质量比1:10?100混合。
4.如权利要求2所述的一种绿色荧光碳点的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述水热反应的温度为150?300°C，持续2?4h。
5.如权利要求2所述的一种绿色荧光碳点的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的离心是以4000r/min转速离心lOmin。
6.如权利要求2所述的一种绿色荧光碳点的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的透析是用截留分子量为500?100Da的透析袋透析48h。
7.如权利要求2-6任一权利要求所述方法制备的绿色荧光碳点。
8.如权利要求7所述的绿色荧光碳点在细胞成像方面的应用。
【文档编号】G01N21/64GK104403664SQ201410623730
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】石利红, 李艳艳, 李晓峰, 温香平, 双少敏 申请人:山西大学