一种出血性大肠杆菌o157:h7酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种出血性大肠杆菌O157:H7酶联免疫检测试剂盒，它包括盒体，所述盒体内设有自封袋和衬垫，所述自封袋内设有包被了抗出血性大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的酶标反应板，所述衬垫上设有数个容器孔，所述容器孔内分别设有阳性对照溶液、阴性对照溶液、10×浓缩洗涤液、显色液、终止液、酶标抗体溶液和酶标抗体稀释液，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗出血性大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体。本实用新型的试剂盒可特异、高效地检测出血性大肠杆菌O157:H7。
【专利说明】—种出血性大肠杆菌0157:H7酶联免疫检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物技术和免疫学领域，具体涉及一种检测出血性大肠杆菌0157:H7的酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002]出血性大肠杆菌0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)是肠道大肠杆菌的主要血清型，可通过牛肉及其制品、牛奶及其制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等传播。出血性大肠杆菌0157:H7可引起肠炎，受感染病人的典型临床症状为血便、腹痛、低热或不发热，约有10%的病人可发展成为溶血性尿毒症及血栓性血小板减少性紫癜，并且可对被感染病人的肠道、肝、脾、肾、淋巴、脑、呼吸系统和神经系统造成损伤。老人和儿童为高危人群，易发生溶血性尿毒症，死亡率高达30%以上。世界卫生组织已经将出血性大肠杆菌0157:H7肠炎列为新发传染病。出血性大肠杆菌0157:H7感染已经成为一个世界性的卫生问题。
[0003]目前出血性大肠杆菌0157:H7的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。分子生物学和免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但是检测产品全部依赖进口，我国目前尚无拥有完全自主知识产权，且可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以出血性大肠杆菌0157:H7为检测靶标，所要求保护的技术涉及出血性大肠杆菌0157:H7快速检测产品。
实用新型内容
[0004]本实用新型的目的是提供一种检测出血性大肠杆菌0157:H7的检测试剂盒。
[0005]具体而言，本实用新型提供了一种出血性大肠杆菌0157:H7酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，所述盒体内设有自封袋和衬垫，所述自封袋内设有包被了作为捕捉抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的酶标反应板，所述衬垫上设有数个容器孔，所述容器孔内分别设有阳性对照溶液、阴性对照溶液、IOX浓缩洗涤液、显色液、终止液、酶标抗体溶液和酶标抗体稀释液，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的作为检测抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体。
[0006]在一优选例中，所述酶标反应板由支撑架和设于支撑架上的可拆卸式微孔条构成，所述微孔条上设有微孔，所述微孔中包被有作为捕捉抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体。
[0007]在另一优选例中，所述的作为捕捉抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系3A8F11B10E7产生，所述作为检测抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系GS2-D3产生。
[0008]此外，在本实用新型的试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。
[0009]本实用新型的酶联免疫试剂盒的检测原理及有益效果如下:
[0010]本实用新型的试剂盒采用的是双抗体夹心酶联免疫法。当在酶标反应板微孔条上预包被抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体(捕捉抗体)时,加入样品溶液或标准品后，再加入辣根过氧化物酶标记的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体(检测抗体)，样品或标准品中存在的出血性大肠杆菌0157:H7与酶标反应板上包被的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体相结合，加入检测抗体后，会形成“抗体一抗原一酶标抗体”复合物，经过TMB(四甲基联苯胺)显色后会形成黄色物质，从而判断样品中出血性大肠杆菌0157: H7的存在与否以及存在的量。
[0011]用酶标仪于450nm下测定吸光度值。阴性对照≤0.1、阳性对照≤0.3，实验结果有效，否则结果判定为无效；检测孔OD值> 0.2时，判定为阳性；检测孔OD值介于0.1-0.2之间时，判定为弱阳性；检测孔OD值< 0.1判定为阴性。
[0012]试验表明，本实用新型的出血性大肠杆菌0157:H7酶联免疫试剂盒，有较高的灵敏度和准确度。板间误差小于10%，板内CV小于3%。与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等均无交叉反应。
[0013]总之，本实用新型的试剂盒对样品的前处理要求低，操作简便，检测极限为105cfu/ml，特异性和稳定性好，并与大多数食源性致病菌都没有交叉反应。
[0014]本实用新型各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本实用新型的特点、目的和优势将更为明显。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是本实用新型的检测试剂盒的结构示意图； [0016]图2是本实用新型的检测试剂盒的酶标反应板的示意图。
[0017]附图标记释义:1.盒体；2.衬垫；3.容器孔；4.微孔板；5.支撑架；6.微孔条；
7.微孔。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0019]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本实用新型中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0020]实施例1.本实用新型的检测试剂盒的组成、制备及其应用[0021 ] 一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成(如图1、图2 ):
[0022](I)预包被抗体的酶标反应板(4):酶标反应板由支撑架(5)和设置在支撑架上的可拆卸式微孔条(6)构成，所述微孔条(6)上设有微孔(7)。用0.02M醋酸缓冲液(pH2.0)溶液稀释、抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体3A8F11B10E7包被96孔酶标反应板(4)上的微孔(7)，每孔100μΙ。4°C孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤。酶标反应板装于铝箔自封袋内。
[0023](2 )出血性大肠杆菌0157: H7阳性对照标准品(灭活的出血性大肠杆菌0157: H7菌液)一管和阴性对照标准品(灭菌的改良E.C新生霉素增菌肉汤)一管。
[0024](3)辣根过氧化物酶标记的抗出血性大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体GS2-D3溶液一管。
[0025](4)酶标抗体稀释液一管:0.0lM PBS，ρΗ7.6。
[0026](5)10Χ浓缩洗涤液一管:含有0.5%吐温-20和0.2%叠氮钠的0.1M磷酸盐缓冲液，ΡΗ7.4，使用时将浓缩洗液10倍稀释即可。
[0027](6 )显色液A液一管，显色液B液一管。使用前将A液与B液等体积混合。
[0028](7)终止液一管:2Μ硫酸溶液。
[0029](8 )设有数个容器孔(3 )的衬垫(2 )。
[0030]二、酶联免疫试剂盒中各组分的制备
[0031](一)将出血性大肠杆菌单克隆抗体3A8F11B10E7作为捕获抗体包被酶标反应板
[0032]用包被缓冲液将出血性大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体3A8F11B10E7稀释成5 μ g/ml，每孔加入100 μ I，4°C过夜，次日倾去包被液，用稀释好的洗液洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入220 μ I封闭液，37°C温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝箔袋密封保存。
[0033]包被缓冲液:0.02M醋酸缓冲液，用5M HCl调节pH至2.0。
[0034]封闭液:含有0.3%牛血清白蛋白和10%蔗糖的0.0lM PBS0
[0035](二)辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体GS2-D3的制备
[0036]将出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体GS2-D3与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是改良的过碘酸钠法，方法如下:
[0037]a、5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶解于0.5ml0.2M醋酸缓冲液(ρΗ5.6)中。
[0038]b、加入现配制的 0.06M Na104 溶液 0.5ml，4°C氧化 20min。
[0039]C、加入含22%NaCl的0.4M乙二醇溶液0.5ml，室温静置30min。
[0040]d、用6ml预冷的无水乙醇沉淀酶，1500rpm离心lOmin。
[0041]e、去上清，将沉淀溶于2.5ml的0.0lM PBS (ρΗ7.4)中。
[0042]f、加入IOmg单克隆抗体GS2-D3，并立即用0.5M碳酸缓冲液(ρΗ9.6)调节pH至9.0。4°C静置过夜。
[0043]g、加入 10mg/ml 硼氢化钠 50 μ 1，4°C，静置 2h。
[0044]h、用 0.0lM PBS (ρΗ7.4) 4°C透析过夜。
[0045]1、纯化保存。
[0046]三、试剂盒的应用
[0047](一)检测方法
[0048]1、样品前处理
[0049]取待检样品25g(ml)加入225ml改良EC肉汤(mEC+n)于均质机下均质混勻，360C ±1°C培养16h。将培养好的样品在100°C水浴中加热lOmin。取出冷却至室温待用。
[0050]2、用试剂盒检测
[0051]取出所需数量的微孔和所有试剂常温下放置30min。取200 μ I待检样品加到微孔中，37°C，孵育30min。倒去孔内液体，加入200 μ I洗液到每个微孔内，轻轻晃动数秒，快速翻转将微孔内液体倒尽，向一叠干净的吸水纸拍几下，如此重复操作共洗板3次。加入100 μ I酶标单克隆抗体GS2-D3工作液，37°C，孵育60min。倒去孔内液体并洗板4次。将显色A液和显色B液等量混合配成底物显色液。每个微孔加入100 μ I的底物显色液，室温避光显色15-20min。加入终止液100 μ I，用酶标仪于450nm下测定吸光度值。
[0052]结果判定:阴性对照< 0.1、阳性对照≥0.3，实验结果有效，否则结果判定为无效；检测孔OD值≥0.2时，判定为阳性；检测孔OD值介于0.1-0.2之间时，判定为弱阳性；检测孔OD值< 0.1判定为阴性。
[0053]若无酶标仪，可用肉眼判定:阳性对照孔有肉眼可见的黄色，阴性对照孔无颜色，实验结果有效，否则判定为实验结果无效；当检测孔有明显肉眼可见的黄色时为阳性结果；有微弱黄色时，判定为弱阳性结果；无肉眼可见黄色时为阴性结果。
[0054](二)酶联免疫试剂盒效果的检测
[0055]1、试剂盒重复性和稳定性测试
[0056]板内精密度测试:取同一块酶标反应板上的6个微孔，用被大肠0157:H7污染过的牛奶进行测试，实验重复4次。
[0057]板间精密度测试:取同一批次的4块酶标反应板，用被大肠0157: H7污染过的牛奶进行测试，实验重复3次。
[0058]变异系数的计算方法:变异系数(CV)=测定结果的标准差与其平均值的百分比。
[0059]表1.板内精密度测试结果
[0060]
【权利要求】
1.一种出血性大肠杆菌0157:H7酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，其特征在于，所述盒体内设有自封袋和衬垫，所述自封袋内设有包被了作为捕捉抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的酶标反应板，所述衬垫上设有数个容器孔，所述容器孔内分别设有阳性对照溶液、阴性对照溶液、IOX浓缩洗涤液、显色液、终止液、酶标抗体溶液和酶标抗体稀释液，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的作为检测抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶标反应板由支撑架和设于支撑架上的可拆卸式微孔条构成，所述微孔条上设有微孔，所述微孔中包被有作为捕捉抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体。
3.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述作为捕捉抗体的抗出血性大肠杆菌0157: H7单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系3A8F11B10E7产生，所述作为检测抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系GS2-D3产生。
【文档编号】G01N33/577GK203732546SQ201420072168
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】刘箐, 郭慧琴, 邱实 申请人:上海理工大学