一种乙酰胆碱酯酶生物传感器及其应用的制作方法

本发明涉及一种乙酰胆碱酯酶生物传感器及其应用，具体涉及基于铂钯合金负载二氧化锰纳米复合材料的电化学生物传感器及其应用，属于电化学检测技术领域。

背景技术：

农药作为农业生产过程中一种特殊的生产资料，它可以消灭虫害、增加产量、保证收成，还能预防和控制人类传染病。但农药大量使用引发的食品安全问题也日益突出。农药通过被污染的农产品进入人体，人将产生中毒现象，一些有害元素可能引起人体细胞癌变，甚至还会影响到后代健康。因此，为了提高和保障食品质量和生命安全，对农药残留的高灵敏检测成为了近几年国内外关注的焦点。目前，农药残留检测气相色谱、高效液相色谱、色谱-质谱联用技术、毛细管电泳、表面增强拉曼光谱法、免疫分析、生物传感器等技术已被应用到农药残留检测的实际工作中。但由于气相色谱、高效液相色谱和色谱-质谱联用技术，仪器昂贵且不易实现微型化，样品的前处理过程相对比较复杂；毛细管电泳则毛细管直径小，光路短，重现性差；表面增强拉曼光谱法重现性和稳定性差。因此构建简便、快速、准确和高效的农药残留检测方法，有效的解决由农药残留超标导致的卫生安全和环境污染已经成为目前的焦点。

电化学生物传感器在目前的传感器中占有重要的地位，其具有灵敏度高、仪器自动化程度高、样品消耗少、响应时间短、操作简便、成本低廉，以此同时其检测信号转换为直观易读的浓度值，便于非专业人士使用，目前已被广泛应用于生物医学、环境科学、药物学以及食品科学等领域。酶方法在农药残留的检测中也引起了人们的广泛关注，主要是由于具备操作简单、选择性好、灵敏度高、响应时间快和检测仪器的微型化等以上优点。

钯负载二氧化锰纳米材料目前已经被大量的发表和广泛的引用到很多与化学相关的领域，钯属于贵金属元素，具有好的电催化活性和导电性，除此之外铂也具有钯较好的电催化活性和分散性，因此将钯铂做成合金同时负载到二氧化锰上，制备的此合金材料具有更强的电催化活性，并且可以首次通过此种材料来固定乙酰胆碱酯酶进而用来定量检测甲基对硫磷和呋喃丹等农药，达到对农药检测所要求的灵敏度高、选择性好、检测时间短等需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种电催化活性高、灵敏度高、选择性好、检测时间短且有助于乙酰胆碱酯酶的固定的基于铂钯合金负载二氧化锰纳米复合材料的电化学生物传感器及其应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：基于铂钯合金负载二氧化锰纳米复合材料的乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器的制备，它包括以下步骤：首先，以KMnO₄、CTAB、PEG400和柠檬酸钠、硼氢化钠、PdCl₂和H₂PtCl₆为起始原料，采用水浴方法制备Pd-Pt@MnO₂纳米复合材料。采用滴涂法将制备的Pd-Pt@MnO₂修饰到玻碳电极表面；其次，用壳聚糖(CS)固定乙酰胆碱酯酶(AChE)，采用物理吸附将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定在Pd-Pt@MnO₂修饰玻碳电极表面，基于Pd-Pt@MnO₂良好的电化学性能，构建成电化学生物传感器应用于对甲基对硫磷和呋喃丹等农药的快速、灵敏检测，其构建过程与检测机理：

乙酰胆碱酯酶催化底物硫代乙酰胆碱水解，生成产物硫代胆碱和醋酸。硫代胆碱在特定电位下易被氧化，产生电流。在底物浓度一定的条件下，电流信号大小与生物传感器的催化响应有关。在有农药存在条件下，农药与乙酰胆碱酯酶的活性内羟基结合，生成对硫代乙酰胆碱无催化活性的磷酰化乙酰胆碱酯酶：

乙酰胆碱酯酶对底物的催化活性受到农药的抑制，产生的硫代胆碱浓度下降，电流减小.随着农药浓度的增加，其对酶电极的抑制率增加，根据下式计算百分抑制率[15]:

抑制率＝[(I0–I1)/I0]×100％(1)

(1)式中，I0是指乙酰胆碱酯酶传感器对一定浓度的硫代乙酰胆碱产生的稳态电流，是指乙酰胆碱酯酶传感器经农药抑制后对同一浓度硫代乙酰胆碱产生的稳态电流，通过比较酶抑制前后的电流信号即氧化峰大小，实现对对甲基对硫磷，西维因和呋喃丹等农药的定量检测。

本发明的乙酰胆碱酯酶生物传感器经由如下步骤得到：

(1)Pd-Pt@MnO₂-nanoflakes纳米复合材料的制备

①MnO₂-nanoflakes材料的制备

911mg十六烷基三甲基溴化铵溶于25ml的超纯水中，加热回流至温度保持在140℃时，接着加入KMnO₄其质量为79.02mg溶于25mL的超纯水中,待温度恒定保持在140℃时回流8至10分钟，颜色由紫色变为深棕色，冷却至室温，用乙醇洗三次，用水定容至10mL，即得到MnO₂-nanoflakes纳米复合材料；

②Pd-Pt@MnO₂-nanoflakes复合材料的制备

取5mL①制得的MnO₂nanoflakes材料，加入0.5mL 10mM PdCl₂，0.5mL10mM H₂PtCl₆,0.1mL PEG400和1.0mL 10mM柠檬酸钠搅拌混匀，最后加入3mL15mM硼氢化钠反应4h，之后用水洗三次离心，定容至5mL，即得到Pd-Pt@MnO₂复合材料；

(2)玻碳电极表面预处理

将直径为3mm的玻碳电极Glassy carbon electrode用Al₂O₃糊抛光处理成镜面，依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗，放置于空气中自然干燥，然后在pH 7.4的PBS溶液中于+1.75V恒电位下扫描300s，再于+0.3V～+1.25V和+0.3V～－1.3V之间循环扫描20次，待电流稳定后，用二次水冲洗电极并在空气中自然干燥备用；

(3)电化学生物传感界面的构建

取6uL得到的Pd-Pt@MnO₂悬浮液滴涂于预先处理好的玻碳电极表面，放在室温下干燥，即得到Pd-Pt@MnO₂修饰玻碳电极，记为Pd-Pt@MnO₂/GCE；最后待Pd-Pt@MnO2修饰玻碳电极干后再接着在电极表面滴涂4.5μL乙酰胆碱酯酶(AChE)和壳聚糖(CS)混合物，其中：乙酰胆碱酯酶为3μL和壳聚糖为1.5μL，在4℃环境下干燥过夜，即得到AChE-CS/Pd-Pt@MnO₂/GCE；

(4)建立对甲基对硫磷和呋喃丹农药检测的标准曲线

把AChE-CS/Pd-Pt@MnO₂/GCE作为工作电极，饱和甘汞电极(saturated calomel electrode)作为参比电极，铂电极(platinum wire electrode)作为对电极，测定农药时将工作电极置于含有不同浓度甲基对硫磷和不同浓度呋喃丹的中抑制4min用循环伏安扫描20次，待背景电流稳定后，在2mmol/L的巯基乙酰胆碱(ATCl)溶液中25℃下温育10min，记录它们各自所产生的循环伏安图，电流值随农药的不同浓度呈规律的变化，绘制标准曲线并确定农药的最佳线性范围和检测限；甲基对硫磷农药检测的线性范围为(10^-13)mol/L～(10^-8)mol/L，其检出限为(0.35×10^-13)mol/L；呋喃丹农药检测的线性范围为(10^-12)mol/L～(10^-8)mol/L，其检出限为(0.3×10^-12)mol/L。

本发明的乙酰胆碱酯酶生物传感器在对甲基对硫磷和呋喃丹农药检测中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、利用水浴的方法制备Pd-Pt@MnO₂纳米复合材料，其具有优异的电催化活性和生物相容性；

2、所构建的电化学生物传感器，成功实现了对甲基对硫磷和呋喃丹农药的高灵敏检测，其中甲基对硫磷农药检测的线性范围为(10^-13)mol/L～(10^-8)mol/L，其检出限为(0.35×10^-13)mol/L；呋喃丹农药检测的线性范围为(10^-12)mol/L～(10^-8)mol/L，其检出限为(0.3×10^-12)mol/L；

3、本发明基于农药对酶修饰电极的抑制作用，实现了电化学检测农药残留的目的，该方法所需样品少、检测时间短且灵敏度较高，适用于农药残留的分析与检测。

附图说明

图1为几种不同材料电极的循环伏安图，图中都出现了一个不可逆的氧化峰：a.AChE-CS/GCE b.AChE-CS/MnO₂-nanoflakes/GCE c.AChE-CS/Pd-Pt@MnO₂/GCE。

图2黑色的线为电化学生物传感器电极Pd-Pt@MnO₂/AChE-CS/GCE应用于检测不同浓度甲基对硫磷的DPV图。

图3黑色的线为电化学生物传感器电极Pd-Pt@MnO₂/AChE-CS/GCE应用于检测不同浓度呋喃丹农药的i-t曲线。

图4黑色的线为电化学生物传感器电极Pd-Pt@MnO₂/AChE-CS/GCE应用于检测不同浓度甲基对硫磷的标准曲线。

图5黑色的线为电化学生物传感器Pd-Pt@MnO₂/AChE-CS/GCE应用于检测不同浓度呋喃丹农药的标准曲线。

具体实施方式

实施例中乙酰胆碱酯酶生物传感器制备的经由步骤同发明内容部分所述。

实施例一：

首先，制备分散性好的Pd-Pt@MnO₂纳米复合材料：911mg十六烷基三甲基溴化铵溶于25mL的超纯水中，加热回流保持在140℃时，接着加入KMnO₄其质量为79.02mg溶于25mL的超纯水，待温度恒定保持在140℃时回流8至10分钟，颜色由紫色变为深棕色，冷却室温，用无水乙醇洗三次，用水定容至10mL(相当于6mg/mL)，即得到MnO₂-nanoflakes材料。取5mL制得的MnO₂-nanoflakes材料，加入0.5mL 10mM PdCl₂，0.5mL 10mM H₂PtCl₆,0.1mLPEG400和1.0mL10mM柠檬酸钠搅拌混匀，最后加入3mL 15mM硼氢化钠反应4h，之后用水洗三次，离心，定容至5mL，即得到Pd-Pt@MnO₂复合材料。

取6uL上述得到的Pd-Pt@MnO₂悬浮液滴涂于预先处理好的玻碳电极GCE表面，放在室温下干燥，即得到Pd-Pt@MnO₂修饰玻碳电极，记为Pd-Pt@MnO₂/GCE；最后在已干的Pd-Pt@MnO₂修饰的玻碳电极表面滴涂4.5μL乙酰胆碱酯酶(AChE)和壳聚糖(CS)混合物，在4℃环境中干燥过夜，即得到AChE-CS/Pd-Pt@MnO₂/GCE；

选用10^-13mol/L～10^-8mol/L浓度范围的甲基对硫磷农药在PBS(0.1mol/L pH 7.4)中用循环伏安扫描20次，待背景电流稳定后，在2mmol/L的巯基乙酰胆碱ATCl溶液中25℃下育温10min，记录它们各自所产生的循环伏安图(如图2所示)。用DPV进行定量测定(如图2所示)，建立标准曲线(如图4所示)，确定该电化学生物传感器的检出限为0.35×10^-13mol/L。

实施例二：

首先，制备分散性好的Pd-Pt@MnO₂纳米复合材料：911mg十六烷基三甲基溴化铵溶于25mL的超纯水中，加热回流至温度保持在140℃时，接着加入KMnO₄其质量为79.02mg溶于25mL的超纯水中140℃，待温度恒定保持在140℃时回流8至10分钟，颜色由紫色变为深棕色，冷却室温，用无水乙醇洗三次，用水定容至10mL(相当于7mg/mL)，即得到Pd-Pt@MnO₂复合材料。

取6uL得到的Pd-Pt@MnO₂悬浮液滴涂于预先处理好的玻碳电极GCE表面，放在室温下干燥，即得到Pd-Pt@MnO₂修饰玻碳电极，记为Pd-Pt@MnO₂/GCE；最后在已干的Pd-Pt@MnO₂修饰的玻碳电极表面滴涂4.5μL乙酰胆碱酯酶(AChE)和壳聚糖(CS)混合物，在4℃环境中干燥，过夜，即得到AChE-CS/Pd-Pt@MnO₂/GCE；

选用10^-12mol/L～10^-8mol/L浓度范围的呋喃丹农药在PBS(0.1mol/L pH7.4)中用循环伏安扫描20次，待背景电流稳定后，在2mmol/L的巯基乙酰胆碱ATCl溶液中25℃下育温10min，记录它们各自所产生的循环伏安图(如图1所示)。用i-t曲线进行定量测定(如图3所示)，建立标准曲线(如图5所示)，确定该电化学生物传感器的检出限为0.3×10^-12mol/L。