一种薄层色谱耦合气相色谱质谱联用技术分析烟草污染物的方法与流程

本发明属于烟草及烟草制品的污染化合物的筛查分析技术领域，具体涉及一种薄层色谱耦合气相色谱质谱联用技术分析烟草污染物的方法。

背景技术：

烟叶在生产、运输以及存放的过程中会受到外源物质的污染，从而影响烟叶的香气和吃味。但是受到污染的烟叶究竟是被哪种物质污染，以及污染源来自何处等问题，在实际工作中较难解决。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种薄层色谱耦合气相色谱质谱联用技术分析烟草污染物的方法，其具有工序简单、检测时间短的特点，可有效提高烟草污染物的筛查效率。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种薄层色谱耦合气相色谱质谱联用技术分析烟草污染物的方法，包括以下步骤：

1)向烟末样品中加入萃取剂进行萃取，过滤，得到上清液；

2)取上清液进行薄层层析，在薄层板上得到互相分离的组分斑点；

3)取下组分斑点并加入溶剂进行洗脱溶出，得到溶出液；

4)将溶出液进行气相色谱质谱联用分析，得到样品谱图；将样品谱图与标准烟样的谱图进行比较，确定差异色谱峰；依据差异色谱峰的谱峰信息确定污染物。

薄层色谱(TLC)又叫薄板层析，其是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板上，形成薄层后，在此薄层上进行层析分离的分析方法。薄层层析的主要操作步骤包括：薄层板的制备、样品的滴加、展开、显色、比较Rf值及定量分析等。由于样品中各组分的性质不同，经移动展开后，可得相互分离的组分斑点。

气相色谱质谱联用技术即将气相色谱仪与质谱仪通过接口组件进行连接，以气相色谱作为试样分离、制备的手段，将质谱作为气相色谱的在线检测手段进行定性、定量分析，辅以相应的数据收集与控制系统构建而成的一种色谱-质谱联用技术。

本发明是利用结合薄层色谱和气相色谱质谱联用技术，建立烟叶中外源性物质的筛查方法，为找出烟叶的污染源提供了一种新途径。该方法利用烟样中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能不同，或和其他物质亲和作用性能的差异，实现不同溶质快速分离；再利用气相色谱质谱联用仪进行痕量试样的研究；薄层色谱和气相色谱质谱联用技术的结合对于烟样中污染物的筛查具有极强的适用性，可以更好的促进傅里叶变换红外分析仪-气相色谱质谱联用仪技术在烟叶污染物筛查领域的应用。该方法充分利用两种技术的优势，具有操作简单、检测时间短的特点，可有效提高烟草污染物的筛查效率。

步骤1)中，所述萃取剂为环己烷、甲苯、丙酮、水中的任意一种或多种。进一步优选的，所述萃取剂为甲苯和/或丙酮。每20mL～30mL萃取剂中，烟末样品的加入量为1.0g；萃取时，在150rpm下振荡30min，静置，过滤，即得上清液。

步骤2)中，薄层层析时，所用展开剂为丙酮、甲醇、环己烷、乙酸乙酯中的任意一种或多种。进一步优选的，所述展开剂为甲醇和/或丙酮。

薄层层析时，所用薄层板可自制或采用市场常规产品。为缩减试验时间，减少工作量，提高试验准确性，可直接选用市售经过活化的荧光薄层板。

点样时，样品的滴加宜在密闭的容器中进行，避免因空气中水分而降低活化板的吸附性。若在空气中滴加，一般不超过10min。样品滴加的方法与纸上层析相似：样品量为5～10μg，滴加后的原点扩散直径不超过0.5cm，样点间距离不低于1.5cm，点样起点距薄层板底部边缘至少1.5cm。

薄层层析时，薄层板浸入展开剂的深度不超过0.5cm。展开时，可在展开容器内粘附展开剂浸过的滤纸条以加速蒸汽的饱和，实现对展开容器的预饱和。薄层板的展开距离为10～14cm，展开时间为30～60min，溶剂达到预先用铅笔划好的前沿后，取出板，在100℃加热20～30分钟或者常温干燥，然后用254nm紫外灯照射，观察现象。可采用一次上行法、双向上行法或递次上行法进行展开。薄层层析装置可采用现有技术，或采用申请号为CN201620567847.2的专利公开的薄层层析装置。

步骤3)中，所述溶剂为丙酮。

步骤4)中，气相色谱质谱联用分析的分析条件为：色谱柱：HP-5MS(60m*250μm*0.25μm)毛细管柱；进样口温度：280℃；载气：He，1ml/min；传输线温度：270℃；EI源电子能量：70eV；倍增器电压：1450V；质量扫描范围：30～550amu；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；进样量：1μL；分流比：1:10；程序升温：起始温度：50℃，保持2min，然后以5℃/min升温到250℃，保持6min；溶剂延迟时间为6min。

步骤4)中，根据差异色谱峰的保留时间，在谱峰数据库中进行检索，即可确定污染物。谱峰数据库可选择NIST库。

本发明的薄层色谱耦合气相色谱质谱联用技术分析烟草污染物的方法，确定了萃取、薄层色谱和气相色谱质谱联用分析的分析条件，优化了样品处理方法和色谱条件，可以简便、快速有效的测定烟草污染物，提高对烟草污染物的筛查效率。

附图说明

图1为本发明的测定方法的流程图；

图2为实施例1的污染烟样溶液的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例的薄层色谱耦合气相色谱质谱联用技术分析烟草污染物的方法，流程示意图如图1所示，包括以下步骤：

1)向50mL的三角瓶中加入20mL丙酮和1.0g烟末样品，将三角瓶置于振荡器中在150rpm下振荡30min，静置，过滤，得到上清液；

2)取上清液进行薄层层析，所使用薄层板为活化的荧光薄层板，包括以下步骤：

①用10μL移液枪定量移取4μL上清液进行点样；点样直径不超过0.5cm，样点间距离为1.5cm，点样起点距薄层板底部边缘为1.5cm；

②以丙酮为展开剂在密闭容器中进行展开；展开前，对展开容器进行预饱和；展开时，薄层板进入展开剂的深度不超过0.5cm，50min后，展开达到12.2cm，将薄层板在100℃加热20min烘干；烘干后在254nm紫外灯下观察到相互分离的组分斑点；

3)用铅笔圈出组分斑点并刮下，加入丙酮洗脱溶出，得到溶出液；将溶出液进行气相色谱质谱分析，分析条件为：色谱柱：HP-5MS(60m*250μm*0.25μm)毛细管柱；进样口温度：280℃；载气：He，1ml/min；传输线温度：270℃；EI源电子能量：70eV；倍增器电压：1450V；质量扫描范围：30～550amu；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；进样量：1μL；分流比：1:10；程序升温：起始温度：50℃，保持2min，然后以5℃/min升温到250℃，保持6min；溶剂延迟时间为6min；

4)比较污染烟样和标准烟样的谱图差异，确定差异色谱峰的保留时间，在NIST库检索出相应化合物，确定污染物。

该实施例中，污染烟样溶液的色谱图如2所示，根据差异特征峰信息，筛查出的污染物为丁二酸2-甲氧基乙基十一烷基酯，CAS号为1000325-81-1。

实施例2

本实施例的薄层色谱耦合气相色谱质谱联用技术分析烟草污染物的方法，包括以下步骤：

1)向50mL的三角瓶中加入30mL甲苯和1.0g烟末样品，将三角瓶置于振荡器中在150rpm下振荡30min，静置，过滤，得到上清液；

2)取上清液进行薄层层析，所使用薄层板为活化的荧光薄层板，包括以下步骤：

①用10μL移液枪定量移取4μL上清液进行点样；点样直径不超过0.5cm，样点间距离为1.5cm，点样起点距薄层板底部边缘为1.5cm；

②以丙酮为展开剂在密闭容器中进行展开；展开前，对展开容器进行预饱和；展开时，薄层板进入展开剂的深度不超过0.5cm，50min后，展开达到12.2cm，将薄层板在100℃加热20min烘干；烘干后在254nm紫外灯下观察到相互分离的组分斑点；

3)用铅笔圈出组分斑点并刮下，加入丙酮洗脱溶出，得到溶出液；将溶出液进行气相色谱质谱分析，分析条件为：色谱柱：HP-5MS(60m*250μm*0.25μm)毛细管柱；进样口温度：280℃；载气：He，1ml/min；传输线温度：270℃；EI源电子能量：70eV；倍增器电压：1450V；质量扫描范围：30～550amu；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；进样量：1μL；分流比：1:10；程序升温：起始温度：50℃，保持2min，然后以5℃/min升温到250℃，保持6min；溶剂延迟时间为6min；

4)比较污染烟样和标准烟样的谱图差异，确定差异色谱峰的保留时间，在NIST库检索出相应化合物，确定污染物。

该实施例中，筛查出的污染物为丁二酸2-甲氧基乙基十一烷基酯，CAS号为1000325-81-1。

实施例3

本实施例的薄层色谱耦合气相色谱质谱联用技术分析烟草污染物的方法，包括以下步骤：

1)向50mL的三角瓶中加入20mL甲苯和1.0g烟末样品，将三角瓶置于振荡器中在150rpm下振荡30min，静置，过滤，得到上清液；

2)取上清液进行薄层层析，所使用薄层板为活化的荧光薄层板，包括以下步骤：

①用10μL移液枪定量移取4μL上清液进行点样；点样直径不超过0.5cm，样点间距离为1.5cm，点样起点距薄层板底部边缘为1.5cm；

②以甲醇为展开剂在密闭容器中进行展开；展开前，对展开容器进行预饱和；展开时，薄层板进入展开剂的深度不超过0.5cm，50min后，展开达到10.8cm，将薄层板在100℃加热20min烘干；烘干后在254nm紫外灯下观察到相互分离的组分斑点；

3)用铅笔圈出组分斑点并刮下，加入丙酮洗脱溶出，得到溶出液；将溶出液进行气相色谱质谱分析，分析条件为：色谱柱：HP-5MS(60m*250μm*0.25μm)毛细管柱；进样口温度：280℃；载气：He，1ml/min；传输线温度：270℃；EI源电子能量：70eV；倍增器电压：1450V；质量扫描范围：30～550amu；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；进样量：1μL；分流比：1:10；程序升温：起始温度：50℃，保持2min，然后以5℃/min升温到250℃，保持6min；溶剂延迟时间为6min；

4)比较污染烟样和标准烟样的谱图差异，确定差异色谱峰的保留时间，在NIST库检索出相应化合物，确定污染物。

该实施例中，筛查出的污染物为丁二酸2-甲氧基乙基十一烷基酯，CAS号为1000325-81-1。

实施例4

本实施例的薄层色谱耦合气相色谱质谱联用技术分析烟草污染物的方法，包括以下步骤：

1)向50mL的三角瓶中加入20mL丙酮和1.0g烟末样品，将三角瓶置于振荡器中在150rpm下振荡30min，静置，过滤，得到上清液；

2)取上清液进行薄层层析，所使用薄层板为活化的荧光薄层板，包括以下步骤：

①用10μL移液枪定量移取4μL上清液进行点样；点样直径不超过0.5cm，样点间距离为1.5cm，点样起点距薄层板底部边缘为1.5cm；

②以甲醇为展开剂在密闭容器中进行展开；展开前，对展开容器进行预饱和；展开时，薄层板进入展开剂的深度不超过0.5cm，50min后，展开达到10.8cm，将薄层板在100℃加热20min烘干；烘干后在254nm紫外灯下观察到相互分离的组分斑点；

3)用铅笔圈出组分斑点并刮下，加入丙酮洗脱溶出，得到溶出液；将溶出液进行气相色谱质谱分析，分析条件为：色谱柱：HP-5MS(60m*250μm*0.25μm)毛细管柱；进样口温度：280℃；载气：He，1ml/min；传输线温度：270℃；EI源电子能量：70eV；倍增器电压：1450V；质量扫描范围：30～550amu；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；进样量：1μL；分流比：1:10；程序升温：起始温度：50℃，保持2min，然后以5℃/min升温到250℃，保持6min；溶剂延迟时间为6min；

4)比较污染烟样和标准烟样的谱图差异，确定差异色谱峰的保留时间，在NIST库检索出相应化合物，确定污染物。

该实施例中，筛查出的污染物为丁二酸2-甲氧基乙基十一烷基酯，CAS号为1000325-81-1。

对比例1

对比例1的检测方法，步骤1)中，以环己烷作为萃取剂，步骤2)中以丙酮作为展开剂，采用与实施例1相同的方法进行薄层层析，50min展开12cm，不能观察到组分斑点。

对比例2

对比例2的检测方法，步骤1)中，以水作为萃取剂，步骤2)中以丙酮作为展开剂，采用与实施例1相同的方法进行薄层层析，50min展开13.2cm，在延展0-4cm处有延展线，说明样品杂质含量多，不适于用于后续的GC-MS分析。

对比例3

对比例3的检测方法，步骤1)中，以甲苯作为萃取剂，步骤2)中以体积比为1:1的环己烷、乙酸乙酯的混合溶剂作为展开剂，采用与实施例1相同的方法进行薄层层析，50min展开10.8cm，不能观察到组分斑点。

对比例4

对比例4的检测方法，步骤1)中，以丙酮作为萃取剂，步骤2)中以体积比为1:1的环己烷、乙酸乙酯的混合溶剂作为展开剂，采用与实施例1相同的方法进行薄层层析，50min展开5.8cm，不能观察到组分斑点。