克林霉素磷酸酯凝胶中有关物质的检测方法与流程

本发明涉及药品的检测检验
技术领域：
，特别是涉及一种克林霉素磷酸脂凝胶中有关物质的检测方法。
背景技术：
：克林霉素磷酸酯凝胶主要用于寻常痤疮的治疗。克林霉素于1966年由magerlerin等以氯取代林可霉素分子中第7位的羟基首次合成。克林霉素磷酸酯是半合成的克林霉素的衍生物，在体外没有抗菌活性，但具有脂溶性，较克林霉素易于透皮吸收，进入体内迅速水解为克林霉素而显示抗菌活性，其作用机理是通过抑制细菌蛋白质早期合成，从而抑制了痤疮棒状杆菌，并消除了炎症。目前，《中国药典》中对于克林霉素磷酸酯凝胶仅有克林霉素含量的测定方法，由于克林霉素磷酸脂凝胶是由主药克林霉素磷酸酯及卵磷脂、羟丙基纤维素等辅料组成，其中辅料、杂质等影响着克林霉素磷酸酯凝胶的质量，故而，这种单纯的含量测定方法并不能对克林霉素磷酸脂凝胶的质量进行有效控制。因此，为保证克林霉素磷酸脂凝胶的有效性、安全性，使克林霉素磷酸脂凝胶生产过程的质量得到有效控制，需要对克林霉素磷酸脂凝胶中的有关物质进行检测，这也是质量控制的非常必要的一种技术手段。技术实现要素：本发明的目的就在于提供一种克林霉素磷酸脂凝胶中有关物质的检测方法，这种限量的检测方法有利于控制制剂的质量，保证制剂的有效性。本发明采用如下技术方案实现：一种克林霉素磷酸酯凝胶中有关物质的检测方法，其特征在于包括如下步骤：a制备供试品溶液：将克林霉素磷酸酯凝胶用体积比为80:20的磷酸缓冲液-90％乙腈甲醇溶液溶解并制成每1ml中含克林霉素磷酸酯2～4mg的溶液，摇匀，滴入3～5滴饱和的雷氏铵盐水溶液，振摇、取上清液滤过，取续滤液作为供试品溶液；b制备对照溶液：精密量取上述供试品溶液适量，用体积比为80:20的磷酸缓冲液-90％乙腈甲醇溶液溶解并制成每1ml中含克林霉素磷酸酯70～110ug的溶液，作为对照溶液；c制备对照品溶液：分别精密称取克林霉素对照品和林可霉素对照品各适量，加上述b)过程制得的对照溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含克林霉素20～40ug与林可霉素4～8ug的混合溶液，作为对照品溶液；采用高效液相色谱法对上述供试品溶液、对照溶液和对照品溶液进行检测，其中高效液相色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相a：体积比为92：8的磷酸缓冲液-90％乙腈甲醇溶液，流动相b：体积比为52：48的磷酸缓冲液-90％乙腈甲醇溶液，检测波长：210nm，柱温：40℃，流速为每分钟1.2ml，以线性梯度洗脱方式洗脱。所述磷酸缓冲液ph为3.9±0.05；所述磷酸缓冲液是采用磷酸3.5ml，加水1000ml和浓氨溶液2.5ml制成。所述线性梯度洗脱方式如下表：时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0955405954195546955本发明的克林霉素磷酸酯凝胶中有关物质的检测方法，通过供试品溶液制备条件的筛选、凝胶剂前处理的净化、色谱条件的筛选，建立了克林霉素磷酸酯凝胶中有关物质的检测方法，通过方法学验证研究表明：所建立的方法准确度高、专属性强、重复性良好、耐用性良好。本发明通过对克林霉素磷酸酯凝胶中有关物质的控制，提高了产品的质量。附图说明图1为本发明提供的供试品溶液色谱图；图2为本发明提供的对照品色谱图；图3为克林霉素线形图；图4为林可霉素线性图。具体实施方式下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。下述实施例中克林霉素磷酸酯凝胶来源于宁夏多维药业有限公司。一、检测方法1、供试品溶液的制备：精密量取克林霉素磷酸酯凝胶适量，置10ml量瓶中，用磷酸缓冲液-90％乙腈甲醇溶液(体积比80:20)溶解并稀释至刻度，制成每1ml中含克林霉素磷酸酯凝胶2～4mg的溶液，摇匀，滴加3～5滴饱和的雷氏铵盐水溶液，振摇，静置，取上清液滤过，取续滤液作为供试品溶液；其中磷酸缓冲液是采用磷酸3.5ml，加水1000ml和浓氨溶液2.5ml制成，必要时用浓氨溶液调节ph值至3.9±0.05。2、对照溶液的制备：精密量取适量过程1制备的供试品溶液，用稀释剂(磷酸缓冲液-90％乙腈甲醇溶液(体积比80:20))定量稀释制成每1ml中含克林霉素磷酸酯70～110ug的溶液，作为对照溶液。3、对照品溶液的制备：分别精密称取克林霉素对照品和林可霉素对照品各适量，加上述过程2制得的对照溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含克林霉素20～40ug与林可霉素4～8ug的混合溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法(通则0512)测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5um或效能相当的色谱柱)；流动相a为磷酸缓冲液(ph3.9)-90％乙腈甲醇溶液(92：8)，流动相b为磷酸缓冲液(ph3.9)-90％乙腈甲醇溶液(52：48)；检测波长为210nm；柱温为40℃；流速为每分钟1.2ml，按表1进行线性梯度洗脱。精密量取供试品溶液、对照品溶液与对照溶液各50ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。表1：线性梯度洗脱方式：时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0955405954195546955供试品溶液色谱图中如有与林可霉素和克林霉素保留时间一致的色谱峰，其含量按照外标法以峰面积计算，分别不得过标示量的0.5％与2.0％；其他单个杂质(除相对保留时间小于0.2的峰外)峰面积不得大于对照溶液主峰面积的2/3倍(2.0％)，其他杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍(6.0％)。供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.02倍的峰忽略不计。将批号为160411、160412批克林霉素磷酸酯凝胶按照上述方法进行有关物质检测，结果统计如下表2：二、供试品溶液的前处理——滴加雷氏铵盐水溶液的影响因素验证在供试品溶液的前处理过程中增加滴饱和的雷氏铵盐水溶液净化过程，将无此过程的供试品溶液与有此过程的供试品溶液进行过滤时间对比、有关物质检测结果对比，统计如下表3：从上述结果可知，加饱和雷氏盐水溶液净化对有关物质的检测结果无影响，并且能够大幅度提高过滤的速度，由原来的2min/2ml缩短为5s/2ml，可知滴加饱和雷氏盐净化此步骤可行。三、方法验证数据1、专属性验证将空白溶剂(按照供试品溶液制备过程，稀释剂+雷氏盐的混合溶液)、空白对照溶液(除有效成分克林霉素磷酸酯外的其他辅料制成的凝胶，按照供试品溶液制备方法制成的溶液)、混合对照品溶液(克林霉素磷酸酯、克林霉素、林可霉素对照品混合溶液)、克林霉素磷酸酯凝胶供试品溶液分别注液相色谱仪进行检测，结果空白溶剂、空白对照溶液、混合对照品溶液对杂质的测定无干扰，专属性良好；杂质分离度良好，峰形对称，检测方法可行，符合检测要求。2、线性验证精密称取克林霉素、林可霉素对照品适量，用稀释剂制成浓度分别为克林霉素100ug/ml、林可霉素20ug/ml的混合对照品储备溶液。将混合对照品储备液分别稀释成5个浓度级，依法进样，以峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，计算回归方程，克林霉素回归方程为y＝2e+06x-2693.7r2＝0.999，林可霉素回归方程为y＝2e+07x+5256.3r2＝0.9997。试验结果表明，克林霉素在0.0992～0.1050mg/ml范围内，呈良好的线性关系，林可霉素在0.0011～0.0198mg/ml范围内，呈良好的线性关系。表4克林霉素有关物质测定线性范围表5林可霉素有关物质测定线性范围3、重复性取同一批号供试品(批号160416)6份，按照有关物质测定方法测定。结果平均含量分别为：克林霉素0.0406％，rsd为1.21％，林可霉素0.0102％，rsd为1.39％，最大单杂平均峰面积为27278，rsd为1.75％，总杂平均峰面积为73145.rsd为1.40％，重复性良好。表6克林霉素、林可霉素有关物质测定复性试验结果表编号123456平均rsd％克林霉素含量(％)0.04010.04070.04090.04000.04060.04130.04061.21林可霉素含量(％)0.01020.01010.010.01020.01040.01030.01021.39表7其他未知最大单杂峰面积及总杂峰面积编号123456平均rsd％最大单杂峰面积278422743626954276632722426547272781.75总杂峰面积743017345874887725427341572145731451.404、溶液稳定性取同一份供试品溶液，自制备后，按有关物质测定方法，分别在0、2、4、6、8、12小时进样测定。结果峰面积平均值为：克林霉素平均值为336003.097，rsd为：0.95％；林可霉素峰面积平均值为154539.517，rsd为1.37％；最大单杂峰面积平均值为：27537.333，rsd为1.65％，总杂峰面积平均值为：72913.524，rsd为0.76％。表明供试品溶液自制备后12小时内测定基本稳定。表8克林霉素稳定性试验结果表9林可霉素稳定性试验结果表10最大单杂稳定性试验结果表11总面积稳定性试验结果当前第1页12