一种将双发射比率荧光量子点探针用于检测多巴胺的荧光分析方法与流程

本发明涉及一种将双发射比率荧光量子点探针用于检测多巴胺的荧光分析方法，属环境功能材料制备技术领域。

背景技术：

多巴胺(da)是一种经常出现在中枢神经，激素和心血管系统中，由人类中枢神经系统所分泌的儿茶酚胺类神经递质，它在人类行为反应和大脑功能，如感官，神经信息传导中起着重要的作用。多巴胺在生物体系中浓度异常会引发一系列神经疾病并对人类健康造成极大的伤害。常见的有，多巴胺的分泌过剩会导致人体能量代谢衰竭和神经性猝死；多巴胺分泌过少又会导致人体对肌肉失控，注意力无法集中甚至帕金森综合征。因此，近些年来，检测多巴胺浓度的方法成为了研究者的一个研究热点。

近些年来，常见的多巴胺检测方法有电化学检测，紫外可见光谱检测，高效液相色谱法和荧光探针法(有机染料和量子点)，但是这些方法都有一定的局限性，比如制备工艺复杂，繁琐的仪器程序，有机溶剂和有毒物质的使用等等，因此，开发一种工艺简单，无毒，成本低廉及高效的检测方法非常必要。

如今，由于工艺简单，成本低，荧光法引起了很多研究者的兴趣。其中，比率荧光检测方法就是其中之一，相比于传统荧光方法，比率荧光检测法更直接且可视化检测效果更加明显，比率荧光检测就是指两个荧光发射强度的比值随着目标分析物的变化而变化，当微量目标物作用后视觉变化非常明显，易于分辨。比率荧光检测的一个突出优点就是通过强度比值的变化提高动态响应的范围，通过建立内标，极大地削弱其他因素的干扰，实现对目标分析物的定量检测。这类荧光组合物中的荧光纳米粒子一般分为两类，无机荧光纳米粒子(fins)和有机荧光纳米粒子(fons)。其中，无机荧光纳米粒子是以量子点来作为荧光物质，量子点(quantumdots,qds)是一种新型的发光纳米材料，具有激发范围宽、发射峰位窄、发光效率高、且峰位可调等特点，是一种理想的荧光探针。量子点(quantumdots，qds)，即半径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒，尺寸在1-10nm范围的球形或接近球形的纳米颗粒，它是在纳米尺度上原子和分子的集合体。当三个维度的尺寸都缩小到临界尺寸以下时，其能量将完全量子化，故称为量子点，因其具有良好的荧光性，被广泛应用在生物方面及其他领域的目标物检测。但是很多无机纳米粒子不能降解，对生物体也有害，因此在无机荧光纳米粒子方面，如何克服这个困难成了许多研究者都在研究的热点。有机荧光材料在生物可降解性，生物相容性和可修饰性方面被视为有很好的前景，但是仍存在很多问题，比如制备复杂，耗时长和原材料有一定毒性。

最近几年，一些文章报道了一种新型的多巴胺检测方法，通过检测碱性条件下氧化合成的聚多巴胺(pda)的光吸收来测定其浓度，这种方法快速直接且成本不高。据报道，多巴胺在碱性条件下可以自聚成聚多巴胺并能沉积在各种物质的表面，这跟天然黑色素聚合物很相似。这些报道都有一个相同点，都是将氧化剂作为一种试剂，通过测定氧化合成产物的光吸收来检测da的浓度。

根据以上文章的启发，本文用具有绿色荧光的聚多巴胺荧光粒子作为响应信号用来检测多巴胺，将二氧化硅纳米硅球来包埋红色的碲化镉量子点(r-qds@sio2)作为双发射比率荧光探针的内标，使其不会造成任何危害或污染并为可视化检测提供颜色背景，根据不同浓度的多巴胺能生成不同深浅的绿色荧光多巴胺粒子来用双发射比率荧光法来对多巴胺的浓度进行荧光检测。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种将双发射比率荧光量子点探针用于检测多巴胺的荧光分析方法，该方法将一定浓度的聚乙烯亚胺溶液和不同浓度的多巴胺溶液反应制备了有绿色荧光的pda，以其作为比率荧光探针的响应信号，以r-qds@sio2作为荧光探针的稳定内标，然后将pda和r-qds@sio2进行组装得到双发射比率荧光传感器，使用了双发射比率荧光分析法来对多巴胺的浓度进行检测。

本发明采用的技术方案是：

一种将双发射比率荧光量子点探针用于检测多巴胺的荧光分析方法，该方法包括以下步骤：

(1)、将硼氢化钠(nabh4)和碲粉加入到离心管中，用针头在离心管盖子上扎上一个小孔用来排出反应多余的氢气，然后加入1-2ml二次蒸馏水使固体完全溶解；将离心管放置于超声机中超声反应，最终的白色透明液体即为所需的前驱体nahte溶液；

(2)、在通氮除氧的条件下，将步骤(1)得到的前驱体nahte溶液注入到通氮除氧的有硫代乙醇酸(tga)存在的水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)水溶液中，混合溶液在氮气保护条件下回流反应，得到所需要的红色荧光量子点；

(3)、将步骤(2)所得到的红色荧光量子点加到正己醇，环己烷和曲拉通x-100的混合溶液中，搅拌均匀后加入正硅酸四乙酯继续搅拌，随后再加入氨水，在室温下反应制得包埋红色量子点的二氧化硅纳米球(r-qds@sio2)，最后加入2-3ml丙酮破乳，离心后除去上清液，反复洗涤几次之后进行干燥，得到不带杂质的r-qds@sio2；

(4)、将10g/l的聚乙烯亚胺溶液分别与不同浓度的多巴胺溶液混合室温下静置后得到带有不同深浅绿色荧光的聚多巴胺荧光纳米粒子，并记录其生长时间，将反应所得的聚多巴胺粒子放入透析袋中透析得到纯净的聚多巴胺荧光纳米粒子；

(5)、将步骤(4)得到的聚多巴胺荧光纳米粒子溶液用0.1m的稀盐酸溶液调节ph到7.0，分别再加入步骤(3)所得到的r-qds@sio2，得到双发射比率荧光探针，直接检测所得双发射比率荧光探针的荧光强度，通过线性拟合得到多巴胺浓度与双比率荧光探针荧光强度的线性关系图，进而根据以上所得的线性关系图可以检测到未知样品中多巴胺的浓度。

其中，步骤(1)中所述的硼氢化钠和碲粉的摩尔比为4-6：1。

其中，步骤(2)中所述的加入硫代乙醇酸(tga)的cdcl2·2.5h2o水溶液的ph为10.5-11.5；其中，cdcl2·2.5h2o、tga和nahte的摩尔比为1：2.0-2.5：0.4-0.6，其中nahte的摩尔量根据步骤(1)中碲粉的摩尔量得出；所述回流反应温度为100℃-130℃。

其中，步骤(3)中所述的红色荧光量子点溶液、正己醇、环己烷和曲拉通x-100的体积比为1:4-6:18-20:4-6；所述加入的正硅酸四乙酯、氨水和量子点的体积比为15-30:15-30：1；所述的搅拌时间为2-3小时；所述反应时间为20-28小时。

其中，步骤(5)中所述包埋红色荧光量子点的氧化硅纳米粒子与绿色荧光的聚多巴胺荧光纳米粒子的质量与体积比为6-10mg：100-1000μl。

本发明的技术优点：该方法以水相合成的红色荧光的碲化镉量子点为光学材料，利用正硅酸四乙酯的水解将其进行包埋，对其进行保护并形成内标材料，在此基础上，混合绿色聚多巴胺荧光纳米粒子形成双发射比率型荧光探针。内部红色荧光量子点受到了氧化硅的保护，受到外部因素的影响很少，荧光强度基本不变，外部绿色荧光聚多巴胺纳米粒子一开始由于聚乙烯亚胺和多巴胺的原因处于生长状态。溶液颜色会从无色渐变到绿色，不同浓度的多巴胺溶液和相同浓度的聚乙烯亚胺会生成不同深浅绿色的聚多巴胺荧光纳米粒子，加入r-qds@sio2后，溶液颜色根据多巴胺浓度的由低到高从红色渐变到绿色，从而实现对多巴胺的可视化检测。所以说本发明获得的量子点双发射比率型荧光探针具有良好的光学性能和实现可视化快速检测多巴胺含量的能力。

附图说明

图1是cdteqds的制备流程图。

图2a是聚多巴胺荧光纳米粒子(a)的透射电镜图、图2b是r-qds@sio2(b)的透射电镜图。

图3是多巴胺(a)和聚多巴胺(b)的红外光谱图。

图4是r-qds@sio2-pda的合成过程和反应机理图。

图5a是pda的荧光光谱图；图5b是r-qds@sio2的荧光光谱图；图5c是r-qds@sio2-pda的荧光光谱图。

图6是pda的反应时间图谱。

图7a是随着多巴胺浓度的增加双发射比率荧光探针荧光强度的变化图谱；

图7b是随着多巴胺浓度的增加发绿色荧光的pda荧光强度的变化图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。

实施例1：

(1)将60.6mg硼氢化钠(nabh4)和51.04mg碲粉加入到离心管中，用针头在离心管盖子上扎上一个小孔用来排出反应多余的氢气，然后加入1.5ml二次蒸馏水使固体完全溶解；将离心管放置于超声机中超声反应2h，最终的白色透明液体即为所需的前驱体nahte溶液。

(2)在通氮除氧的条件下，将步骤(1)得到的前驱体nahte溶液注入到通氮除氧的有138.5μl硫代乙醇酸(tga)存在的水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)水溶液中，其中加入cdcl2·2.5h2o228.34mg，混合溶液在氮气保护条件下120℃回流反应85h，得到所需要的红色荧光量子点。

(3)将步骤(2)所得到的800μl红色荧光量子点加到3.2ml正己醇，14.4ml环己烷和3.2ml曲拉通x-100的混合溶液中，搅拌均匀后加入1.2ml正硅酸四乙酯继续搅拌，随后再加入1.2ml氨水，在室温下反应20h制得r-qds@sio2，最后加入2ml丙酮破乳，离心后除去上清液，反复洗涤几次之后进行干燥，得到不带杂质的r-qds@sio2。

(4)将10g/l的聚乙烯亚胺溶液分别与10-80μm的多巴胺溶液混合室温下静置3h后得到带有不同深浅绿色荧光的聚多巴胺荧光纳米粒子，并记录其生长过程，将反应所得的聚多巴胺粒子放入透析袋中透析24h得到纯净的聚多巴胺荧光纳米粒子。

(5)将步骤(4)得到的聚多巴胺荧光纳米粒子溶液用0.1m的稀盐酸溶液调节ph到7.0，分别再加入6mg(3)所得到的r-qds@sio2，得到双发射比率荧光探针，直接检测所得双发射比率荧光探针的荧光强度，通过线性拟合得到多巴胺浓度与双比率荧光探针荧光强度的线性关系图，进而根据以上所得的线性关系图可以检测到未知样品中多巴胺的浓度。

其中，步骤(1)中所述的硼氢化钠和碲粉的摩尔比为4：1。

其中，步骤(2)中所述的加入硫代乙醇酸(tga)的cdcl2·2.5h2o水溶液的ph为10.5；其中，cdcl2·2.5h2o、tga和nahte的摩尔比为1：2.0：0.4，其中nahte的摩尔量根据步骤(1)中碲粉的摩尔量得出；所述回流反应温度为120℃。

其中，步骤(3)中所述的红色荧光量子点溶液、正己醇、环己烷和曲拉通x-100的体积比为1:4:18:4；所述加入的正硅酸四乙酯、氨水和量子点的体积比为15:15:1；所述的搅拌时间为2小时；所述反应时间为20小时。

其中，步骤(5)中所述包埋红色荧光量子点的氧化硅纳米粒子与多巴胺溶液的质量与浓度比为6mg：10-80μm。

实施例2：

(1)将75.7mg硼氢化钠(nabh4)和51.04mg碲粉加入到离心管中，用针头在离心管盖子上扎上一个小孔用来排出反应多余的氢气，然后加入1.5ml二次蒸馏水使固体完全溶解；将离心管放置于超声机中超声反应2h，最终的白色透明液体即为所需的前驱体nahte溶液。

(2)在通氮除氧的条件下，将步骤(1)得到的前驱体nahte溶液注入到通氮除氧的有115.44μl硫代乙醇酸(tga)存在的水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)水溶液中，其中加入cdcl2·2.5h2o152.23mg，混合溶液在氮气保护条件下120℃回流反应85h，得到所需要的红色荧光量子点。

(3)将步骤(2)所得到的800μl红色荧光量子点加到4.0ml正己醇，15.2ml环己烷和4.0ml曲拉通x-100的混合溶液中，搅拌均匀后加入1.6ml正硅酸四乙酯继续搅拌，随后再加入1.6ml氨水，在室温下反应24h制得r-qds@sio2，最后加入2.5ml丙酮破乳，离心后除去上清液，反复洗涤几次之后进行干燥，得到不带杂质的r-qds@sio2。

(4)将10g/l的聚乙烯亚胺溶液分别与10-80μm的多巴胺溶液混合室温下静置3h后得到带有不同深浅绿色荧光的聚多巴胺荧光纳米粒子，并记录其生长过程，将反应所得的聚多巴胺粒子放入透析袋中透析得到纯净的聚多巴胺荧光纳米粒子。

(5)将步骤(4)得到的聚多巴胺荧光纳米粒子溶液用0.1m的稀盐酸溶液调节ph到7.0，分别再加入8mg(3)所得到的r-qds@sio2，得到双发射比率荧光探针，直接检测所得双发射比率荧光探针的荧光强度，通过线性拟合得到多巴胺浓度与双比率荧光探针荧光强度的线性关系图，进而根据以上所得的线性关系图可以检测到未知样品中多巴胺的浓度。

其中，步骤(1)中所述的硼氢化钠和碲粉的摩尔比为5：1。

其中，步骤(2)中所述的加入硫代乙醇酸(tga)的cdcl2·2.5h2o水溶液的ph为11.5；其中，cdcl2·2.5h2o、tga和nahte的摩尔比为1：2.5：0.6，其中nahte的摩尔量根据步骤(1)中碲粉的摩尔量得出；所述回流反应温度为120℃。

其中，步骤(3)中所述的红色荧光量子点溶液、正己醇、环己烷和曲拉通x-100的体积比为1:5:19:5；所述加入的正硅酸四乙酯、氨水和量子点的体积比为20:20:1；所述的搅拌时间为3小时；所述反应时间为24小时。

其中，步骤(5)中所述包埋红色荧光量子点的氧化硅纳米粒子与多巴胺溶液的质量与浓度比为8mg：10-80μm。

实施例3：

(1)将90.9mg硼氢化钠(nabh4)和51.04mg碲粉加入到离心管中，用针头在离心管盖子上扎上一个小孔用来排出反应多余的氢气，然后加入1.5ml二次蒸馏水使固体完全溶解；将离心管放置于超声机中超声反应2h，最终的白色透明液体即为所需的前驱体nahte溶液。

(2)在通氮除氧的条件下，将步骤(1)得到的前驱体nahte溶液注入到通氮除氧的有133μl硫代乙醇酸(tga)存在的水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)水溶液中，其中加入cdcl2·2.5h2o182.67mg，混合溶液在氮气保护条件下130℃回流反应72h，得到所需要的红色荧光量子点。

(3)将步骤(2)所得到的800μl红色荧光量子点加到4.8ml正己醇，16.0ml环己烷和4.8ml曲拉通x-100的混合溶液中，搅拌均匀后加入2.4ml正硅酸四乙酯继续搅拌，随后再加入2.4ml氨水，在室温下反应28h制得r-qds@sio2，最后加入3ml丙酮破乳，离心后除去上清液，反复洗涤几次之后进行干燥，得到不带杂质的r-qds@sio2。

(4)将10g/l的聚乙烯亚胺溶液分别与10-80μm的多巴胺溶液混合室温下静置3h后得到带有不同深浅绿色荧光的聚多巴胺荧光纳米粒子，并记录其生长过程，将反应所得的聚多巴胺粒子放入透析袋中透析得到纯净的聚多巴胺荧光纳米粒子。

(5)将步骤(4)得到的聚多巴胺荧光纳米粒子溶液用0.1m的稀盐酸溶液调节ph到7.0，分别再加入10mg(3)所得到的r-qds@sio2，得到双发射比率荧光探针，直接检测所得双发射比率荧光探针的荧光强度，通过线性拟合得到多巴胺浓度与双比率荧光探针荧光强度的线性关系图，进而根据以上所得的线性关系图可以检测到未知样品中多巴胺的浓度。

其中，步骤(1)中所述的硼氢化钠和碲粉的摩尔比为6：1。

其中，步骤(2)中所述的加入硫代乙醇酸(tga)的cdcl2·2.5h2o水溶液的ph为11.2；其中，cdcl2·2.5h2o、tga和nahte的摩尔比为1：2.4：0.5，其中nahte的摩尔量根据步骤(1)中碲粉的摩尔量得出；所述回流反应温度为120℃。

其中，步骤(3)中所述的红色荧光量子点溶液、正己醇、环己烷和曲拉通x-100的体积比为1:6:20:6；所述加入的正硅酸四乙酯、氨水和量子点的体积比为30:30:1；所述的搅拌时间为4小时；所述反应时间为28小时。

其中，步骤(5)中所述包埋红色荧光量子点的氧化硅纳米粒子与多巴胺溶液的质量与浓度比为10mg：10-80μm。

试验例1：将50mgr-qds@sio2加到含有10ml蒸馏水的比色管中形成溶液，将10-80μm的多巴胺溶液分别溶入含有5ml10g/l的聚乙烯亚胺溶液的校准测试管中，静置3h后将这个测试管中的溶液用0.1m的稀盐酸溶液将ph均调至7，然后在测试管中依次加入200μlr-qds@sio2溶液，将它们充分混合。然后转移至石英比色皿中进行荧光检测。

图1是红色荧光量子点的制备流程图。

图2的透射电镜图可以看出pda和r-qds@sio2都有很好的分散性，并且r-qds@sio2的尺寸均一。

图3图3是多巴胺(a)和聚多巴胺(b)的红外光谱图。通过多巴胺和聚多巴胺的红外光谱图的对比可以看出聚多巴胺荧光纳米粒子成功合成。

其中，在多巴胺的红外谱图(a)上，1450-1600cm^-1出现的吸收峰为多巴胺苯环上的骨架伸缩振动峰。1285cm^-1处出现的吸收峰为多巴胺上酚羟基c-o键的伸缩振动峰。2954cm^-1和3035cm^-1的吸收峰为多巴胺上c-h键的伸缩振动峰。相比于多巴胺的红外谱图，聚多巴胺的红外谱图(b)上，在1654cm^-1处出现了氨基的伸缩振动峰，这个峰的出现也导致了苯环骨架的伸缩振动峰有所减弱。通过红外分析，证明了聚乙烯亚胺和多巴胺发生了反应，成功制备了聚多巴胺纳米粒子。

图4即为本实验的实验合成过程及机理图。

图5中分别a是绿色荧光的聚多巴胺粒子、b是包埋红色量子点的二氧化硅球、c是两者混合溶液的荧光光谱图。

图6为聚多巴胺荧光纳米粒子在不同生长时间下的荧光光谱图，由此图我们可以确定聚多巴胺的生长时间为3h。

图7a为随着多巴胺浓度的增加双比率荧光探针的荧光强度变化的荧光光谱图，图7b为随着多巴胺浓度的增加单色的荧光探针的荧光强度变化的荧光光谱图。

结果表明，本说明书合成的双发射比率型荧光探针对多巴胺具有良好的光学检测能力和可视化检测效果。