本发明涉及纳米科学、生物传感检测技术、电化学发光等领域，具体涉及一种基于界面转化电化学发光免疫传感器的制备方法及应用。
背景技术：
近几十年来，生物传感器蓬勃发展，为早期临床诊断带来了关键性的突破，高灵敏度、高选择性的生物传感器，一直是国内外分析化学工作者的研究热点，在环境监测、食品安全、临床分析等领域具有广阔的应用前景。电化学发光传感器具有灵敏度高、易于小型化的特点在实际应用中具有巨大的优势，而稳定响应性的电极传感界面是构建这类电化学发光传感器的关键。
纳米材料具有优越的导电性、较大的比表面积和良好的生物兼容性，已经被广泛应用于电化学发光传感器的构建。在构建过程中，既可以作为基底物质，也可以作为生物标记物的放大信号。但纳米材料在构建传感器的过程中存在从传感界面脱落，对底物选择性差，低生物识别能力等问题。另外，早期的电化学免疫传感器通常通过对抗原或抗体进行酶标记来检测信号，但是酶对环境要求较高，特别是酶结合到固体载体表面后容易失活。基于具有酶催化活性的纳米材料构建的无酶电化学免疫传感器引起了人们极大的研究兴趣。因此在构建传感器时，采用界面转化的技术实现发光信号的长期稳定保存，可以解决纳米材料在传感器应用中存在的诸多问题，为电化学发光传感器的发展和创新提供了新的思路，具有十分重要的研究意义。
本发明利用聚苯胺金纳米复合物为基底材料，以具有独特结构的聚多巴胺微球为载体，实现了电化学发光半导体纳米材料在电极界面的固定与高效发光。同时利用聚多巴胺微球和聚苯胺金纳米复合物良好的生物相容性，固定生物标志物实现传感器的构建。利用ito玻璃高温煅烧构建电化学发光免疫传感器，该方法不仅操作容易，具有较高的电化学发光性能，而且对不同生物标志物的检测信号进行长久保存，解决了纳米材料及生物分子缺乏简单而有效的电极固定方法等问题。该方法可以适用于多种生物标志物免疫传感器的制备，在科研和临床中具有广泛的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种简单易行的界面转化电化学发光免疫传感器的制备方法，既可以对生物标志物高效灵敏的检测，还可以实现定量检测。
本发明的目的之二是聚苯胺金纳米复合物对二抗标记物具有很好的固定作用，通过高温煅烧，解决了电极修饰材料脱落、重现性差等问题。
本发明的目的之三是提供长久保存、低成本、通用的生物标志物检测方法，为电化学发光免疫传感器在临床中的应用提供技术基础。
本发明的技术方案如下：
1.一种基于界面转化电化学发光免疫传感器制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将6µl聚苯胺金纳米复合物滴在处理、活化好0.5cm×3.5cm的ito电极表面，于4°c冰箱中储存备用；
（2）将6µl10µg·ml-1抗体溶液滴涂在步骤（1）制得的电极表面，4°c冰箱中孵化1h；
（3）滴加5µl、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4°c冰箱中孵化1h，超纯水清洗晾干；滴加6μl浓度为0.001~20ng/ml的一系列不同浓度的生物标志物溶液，4°c下孵化1h，超纯水洗净，晾干；
（4）滴加6µl聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片标记的抗体溶液，4°c冰箱中孵化1h，超纯水清洗晾干，之后在400°c条件下煅烧30min，作为工作电极，进行电化学发光测试。
2.聚苯胺金纳米复合物溶液的制备，其特征在于，包括以下步骤：
将5ml0.8~2.0mm的haucl4溶液置于45°c水浴锅中预热10min，之后缓慢加入0.5ml20mm的苯胺-环己烷溶液，反应12h，将产品11000rpm离心10min，水洗三次，最后将得到的聚苯胺金纳米复合物分散到3ml超纯水中，4°c保存。
3.聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片溶液的制备，其特征在于，包括以下步骤：
（1）聚多巴胺纳米微球溶液的制备
80~120mg盐酸多巴胺加入到80~120mlph=8.8的tris缓冲溶液与30~70ml异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24h，将产品离心分离并用超纯水洗涤三次，之后将产物分散到5ml超纯水中；
（2）氮化碳纳米片溶液的制备
5g双氰胺置于马弗炉中，550°c烧4h，升温速率5°c/min，之后冷却至室温，称取100mg氮化碳置于100ml超纯水中，先用破壁机打磨10~20min，再超声分散4~8h，将产品5000rpm离心10min，上层溶液备用；
（3）聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片溶液的制备
1ml聚多巴胺纳米微球溶液加入2ml氮化碳纳米片溶液，超声15min，置于4°c下震荡6h，离心分离，之后将产物分散到1ml超纯水中。
4．一种基于界面转化电化学发光免疫传感器制备方法及应用，制备的传感器用于生物标志物检测，其特征在于，步骤如下：将煅烧后的ito电极作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，pt电极作为对电极，用ph为7.4的pbs缓冲溶液配制的50mmol·l-1的k2s2o8溶液作为底液，在电化学发光工作站上以循环伏安模式测定-1.1~0v电势下的发光信号，实现对生物标志物的检测。
本发明的有益成果
1该传感器的制备方法不仅操作容易，成本低廉，而且具有高效的电化学发光性能，解决了纳米材料及生物分子缺乏简单而有效的电极固定方法的问题。
2聚多巴胺微球表面含有丰富的官能团，便于固定生物标记物和抗体，在传感界面转化的过程中作为重要的载体，避免了复杂的抗体固定过程及由此引起的失活问题。
3聚苯胺金纳米复合物对二抗标记物具有很好的固定作用，通过高温煅烧使得传感器发光性能稳定，解决电极修饰材料脱落、重现性差等问题。
4该方法可以适用于多种生物标志物免疫传感器的制备，在科研和临床中具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1一种基于界面转化电化学发光免疫传感器的制备方法
（1）将6µl聚苯胺金纳米复合物滴在处理、活化好0.5cm×3.5cm的ito电极表面，于4°c冰箱中储存备用；
（2）将6µl10µg·ml-1胰岛素抗体溶液滴涂在步骤（1）制得的电极表面，4°c冰箱中孵化1h；
（3）滴加5µl、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4°c冰箱中孵化1h，超纯水清洗晾干；滴加6μl浓度为0.001~20ng/ml的一系列不同浓度的胰岛素溶液，4°c下孵化1h，超纯水洗净，晾干；
（4）滴加6µl聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片标记的抗体溶液，4°c冰箱中孵化1h，超纯水清洗晾干，之后在400°c条件下煅烧30min，将ito电极作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，pt电极作为对电极，用ph为7.4的pbs缓冲溶液配制的50mmol·ml-1的k2s2o8溶液作为底液，在电化学发光工作站上以循环伏安模式测定-1.1~0v电势下的发光信号，实现对胰岛素的检测。
实施例2一种基于界面转化电化学发光免疫传感器的制备方法
（1）将6µl聚苯胺金纳米复合物滴在处理、活化好0.5cm×3.5cm的ito电极表面，于4°c冰箱中储存备用；
（2）将6µl10µg·ml-1前列腺特异性抗原抗体溶液滴涂在步骤（1）制得的电极表面，4°c冰箱中孵化1h；
（3）滴加5µl、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4°c冰箱中孵化1h，超纯水清洗晾干；滴加6μl浓度为0.001~20ng/ml的一系列不用浓度的前列腺特异性抗原溶液，4°c下孵化1h，超纯水洗净，晾干；
（4）滴加6µl聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片标记的抗体溶液，4°c冰箱中孵化1h，超纯水清洗晾干，之后在400°c条件下煅烧30min，将ito电极作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，pt电极作为对电极，用ph为7.4的pbs缓冲溶液配制的50mmol·ml-1的k2s2o8溶液作为底液，在电化学发光工作站上以循环伏安模式测定-1.1~0v电势下的发光信号，实现对前列腺特异性抗原的检测。
实施例3一种基于界面转化电化学发光免疫传感器的制备方法
（1）将6µl聚苯胺金纳米复合物滴在处理、活化好0.5cm×3.5cm的ito电极表面，于4°c冰箱中储存备用；
（2）将6µl10µg·ml-1癌胚抗原抗体溶液滴涂在步骤（1）制得的电极表面，4°c冰箱中孵化1h；
（3）滴加5µl、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4°c冰箱中孵化1h，超纯水清洗晾干；滴加6μl浓度为0.001~20ng/ml的一系列不用浓度的癌胚抗原溶液，4°c下孵化1h，超纯水洗净，晾干；
（4）滴加6µl聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片标记的抗体溶液，4°c冰箱中孵化1h，超纯水清洗晾干，之后在400°c条件下煅烧30min，将ito电极作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，pt电极作为对电极，用ph为7.4的pbs缓冲溶液配制的50mmol·ml-1的k2s2o8溶液作为底液，在电化学发光工作站上以循环伏安模式测定-1.1~0v电势下的发光信号，实现对癌胚抗原的检测。
实施例4聚苯胺金纳米复合物溶液的制备
将5ml0.8mm的haucl4溶液置于45°c水浴锅中预热10min，之后缓慢加入0.5ml20mm的苯胺-环己烷溶液，反应12h，将产品11000rpm离心10min，水洗三次，最后将得到的聚苯胺金纳米复合物分散到3ml超纯水中，4°c保存。
实施例5聚苯胺金纳米复合物溶液的制备
将5ml1.0mm的haucl4溶液置于45°c水浴锅中预热10min，之后缓慢加入0.5ml20mm的苯胺-环己烷溶液，反应12h，将产品11000rpm离心10min，水洗三次，最后将得到的聚苯胺金纳米复合物分散到3ml超纯水中，4°c保存。
实施例6聚苯胺金纳米复合物溶液的制备
将5ml2.0mm的haucl4溶液置于45°c水浴锅中预热10min，之后缓慢加入0.5ml20mm的苯胺-环己烷溶液，反应12h，将产品11000rpm离心10min，水洗三次，最后将得到的聚苯胺金纳米复合物分散到3ml超纯水中，4°c保存。
实施例7聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片溶液的制备
（1）聚多巴胺纳米微球溶液的制备
80mg盐酸多巴胺加入到80mlph=8.8的tris缓冲溶液与30ml异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24h，将产品离心分离并用超纯水洗涤三次，之后将产物分散到5ml超纯水中；
（2）氮化碳纳米片溶液的制备
5g双氰胺置于马弗炉中，550°c烧4h，升温速率5°c/min，之后冷却至室温，称取100mg氮化碳置于100ml超纯水中，先用破壁机打磨10min，再超声分散4h，将产品5000rpm离心10min，上层溶液备用；
（3）聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片溶液的制备
1ml聚多巴胺纳米微球溶液加入2ml氮化碳纳米片溶液，超声15min，置于4°c下震荡6h，离心分离，之后将产物分散到1ml超纯水中。
实施例8聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片溶液的制备
（1）聚多巴胺纳米微球溶液的制备
100mg盐酸多巴胺加入到100mlph=8.8的tris缓冲溶液与50ml异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24h，将产品离心分离并用超纯水洗涤三次，之后将产物分散到5ml超纯水中；
（2）氮化碳纳米片溶液的制备
5g双氰胺置于马弗炉中，550°c烧4h，升温速率5°c/min，之后冷却至室温，称取100mg氮化碳置于100ml超纯水中，先用破壁机打磨15min，再超声分散6h，将产品3000rpm离心10min，上层溶液备用；
（3）聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片溶液的制备
1ml聚多巴胺纳米微球溶液加入2ml氮化碳纳米片溶液，超声15min，置于4°c下震荡6h，离心分离，之后将产物分散到1ml超纯水中。
实施例9聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片溶液的制备
（1）聚多巴胺纳米微球溶液的制备
120mg盐酸多巴胺加入到120mlph=8.8的tris缓冲溶液与70ml异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24h，将产品离心分离并用超纯水洗涤三次，之后将产物分散到5ml超纯水中；
（2）氮化碳纳米片溶液的制备
5g双氰胺置于马弗炉中，550°c烧4h，升温速率5°c/min，之后冷却至室温，称取100mg氮化碳置于100ml超纯水中，先用破壁机打磨20min，再超声分散8h，将产品3000rpm离心10min，上层溶液备用；
（3）聚多巴胺纳米微球负载氮化碳纳米片溶液的制备
1ml聚多巴胺纳米微球溶液加入2ml氮化碳纳米片溶液，超声15min，置于4°c下震荡6h，离心分离，之后将产物分散到1ml超纯水中。