基于毛细管电泳噪声分析确定电泳检测最优参数的方法与流程

本发明涉及一种基于毛细管电泳噪声分析确定电泳检测最优参数的方法，属于电子信息工程领域。

背景技术：

毛细管电泳作为高效的微分离分析方法广泛应用于临床医学、分子生物检测及蛋白质与核酸的分离分析等领域。毛细管电泳系统的结构如图2所示，激光器8的激发光经扩束镜9、激发光滤色片10、调节反光镜11、会聚透镜12照射到毛细管18，毛细管18固定于一维扫描平台6上。物镜17收集荧光，经调节镜13，由荧光滤色片14和共焦小孔15滤除背景噪声，到达光电倍增管16。现有的毛细管电泳系统的荧光信号检测系统中通常包括来自于分析仪器的杂散光噪声、放大电路的噪声、光电倍增管的噪声、静态光学噪声、激光器开启的静态噪声和脱氧核糖核酸电泳时引起的动态噪声等。在毛细管电泳中，有效信号的分离以及碱基信号峰的识别率都受到这些噪声的影响，如果能明确噪声来源，就能有针对性的从源头上采用物理措施、从检测分析阶段采用信号处理方法来抑制噪声，提高荧光信号的信噪比。

奚正山、史大明、郑华、沈鑫等研究者针对毛细管电泳时引起的动态噪声，采用小波分析方法实现该非平稳电泳荧光信号的去噪。石岩通过软件模拟得到毛细管内的激发光光斑对毛细管各个角度的光强，用来考察毛细管内径对噪音分布的影响，通过软件模拟电泳分离DNA的筛分介质引起瑞利散射噪声。YU Li提出光谱恢复的方法、GUILLAUME L.EMY采用电泳背景噪声的估计方法实现信噪比的提升。这些研究方法主要侧重研究毛细管电泳荧光信号检测系统中激光器开启时毛细管电泳时引起的动态噪声，并采用高效的信号处理技术实现信噪比的提升。目前尚无文献全面分析毛细管检测系统噪声的来源、试验条件和实验对象改变时噪声的变化规律。

技术实现要素：

针对现有技术中毛细管电泳系统的荧光信号检测系统存在的上述问题，本发明提供一种基于毛细管电泳噪声分析确定电泳检测最优参数的方法。

本发明的技术方案如下：

基于毛细管电泳噪声分析确定电泳检测最优参数的方法，其特征在于：采用毛细管电泳系统，以100-1000碱基对DNA为分离对象，研究在直流电场下羟乙基纤维素溶液中毛细管电泳分离DNA时的噪声特性，根据不同情况下系统的噪声特性选择最佳系统电泳检测参数。

进一步，所述的基于毛细管电泳噪声分析确定电泳检测最优参数的方法包括如下步骤：

步骤1：分析仪器的噪声的物理抑制；

步骤2：观察放大电路输出噪声；

步骤3：观察光电倍增管输出噪声；

步骤4：观察未加分离电场时的静态噪声；

步骤5：观察加分离电场时DNA毛细管电泳引起的动态噪声；

步骤6：步骤2至步骤5中的噪声分析，得到该检测系统中信噪比最佳的优化参数。

进一步，所述步骤1的具体步骤包括：采用遮光布和遮光板阻挡外部杂散光，构建密闭箱、保持实验室恒温通风环境避免内部杂散光，安装摄影镜头遮光罩和挡光环阻挡成像杂散光。

进一步，所述步骤2的具体步骤包括：关闭光电倍增管，观察放大电路的输出端的噪声情况，其中输出数据通过数据采集卡采集，并经由计算机软件得到噪声时域波形，得到时长为10秒的噪声均值和方差。

进一步，所述步骤3的具体步骤包括：将光电倍增管和放大电路经数据线连接，关闭激光器，将黑纸挡住光电倍增管光路；打开连接光电倍增管电源，测量输出噪声，得到时长为10秒的噪声均值和方差。

进一步，所述步骤4的观察变量条件包括毛细管内未加荧光染料和毛细管内填充荧光染料两种情况；其中：

毛细管内未加荧光染料：毛细管内未添加SYBR Green I荧光染料，只有缓冲溶液；开启激光器，不加分离电场，采集噪声波形，得到时长为10秒的噪声均值和方差；

毛细管内填充荧光染料：毛细管内填充含有SYBR Green I荧光染料的缓冲溶液，不加分离电场，采集噪声波形，得到时长为10秒的噪声均值和方差。

进一步，所述步骤5的观察条件包括基础条件和变量条件，其中：

基础条件为毛细管内填充SYBR Green I荧光染料的缓冲溶液，以100-1000碱基对DNA为分离对象，两端施加直流电压，DNA在毛细管电泳时引起动态噪声；

变量条件包括：

改变分离电场强度时噪声特性：改变分离电场强度200V/cm、300V/cm、400V/cm、500V/cm、600V/cm、700V/cm、800V/cm，其他参数固定，观察DNA在毛细管电泳时引起动态噪声，得到时长为10秒的噪声均值和方差；

改变缓冲溶液浓度时噪声特性：改变缓冲溶液浓度0.4％、0.6％、0.8％、1.0％，其他参数固定，观察DNA在毛细管电泳时引起动态噪声，得到时长为10秒的噪声均值和方差；

改变缓冲溶液分子量时噪声特性：改变缓冲溶液分子量250K、720K、1300K，其他参数固定，观察DNA在毛细管电泳时引起动态噪声，得到时长为10秒的噪声均值和方差；

改变毛细管类型时噪声特性：选用圆形截面毛细管的内径75μm、50μm，毛细管正方形内截面边长为50μm，，其他参数固定，观察DNA在毛细管电泳时引起动态噪声，得到时长为10秒的噪声均值和方差；

改变毛细管有效长度时噪声特性：改变毛细管有效长度8cm、10cm、12cm，其他参数固定，观察DNA在毛细管电泳时引起动态噪声，得到时长为10秒的噪声均值和方差。

进一步，所述步骤6包括分析静态噪声和分析动态噪声，其中：

分析静态噪声：选择合适的物理部件，所述合适的物理部件包括噪声更小、精度更高的放大电路和光电倍增管；

分析动态噪声：选择各种条件小噪声均值和方差均为较小的实验参数，作为最优毛细管电泳检测参数。

本发明的有益效果如下：

从毛细管电泳荧光信号检测系统中噪声来源的角度研究和分析的噪声对系统检测性能的影响，并给出系统最优参数。研究发现影响检测性能的主要噪声来源于激光器开启时电泳所引起的噪声。不同分离电场强度、缓冲溶液浓度和分子量、毛细管有效类型等环节的噪声均不同程度地引起电泳噪声的波动。在实现电泳过程中，需要根据现有条件合理选择仪器参数、试验用品和试验试剂，以实现最佳检测性能。

附图说明

图1是毛细管电泳系统外部结构图；

图2是毛细管电泳系统内部结构图；

图3是基于毛细管电泳噪声分析确定电泳检测系统最优参数的方法流程图。

图中：1、遮光布；2、遮光板；3、密闭箱；4、摄影镜头遮光罩；5、挡光环；6、一维扫描平台；7、数据采集卡；8、激光器；9、扩束镜；10、激发光滤色片；11、调节反光镜；12、会聚透镜；13、调节镜；14、荧光滤色片；15、共焦小孔；16、光电倍增管；17、物镜；18、毛细管。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明采用毛细管电泳系统，以100-1000碱基对DNA为分离对象，研究在直流电场下羟乙基纤维素溶液中毛细管电泳分离DNA时的噪声特性，根据不同情况下系统的噪声特性选择最佳系统电泳检测参数。

毛细管电泳系统置于如图1所示的密闭箱中，毛细管电泳系统检测原理如图2。激光器8的激发光经扩束镜9，激发光滤色片10，调节反光镜11，会聚透镜12照射到毛细管18，毛细管固定于一维扫描平台6。物镜17收集荧光，经调节镜13，由荧光滤色片14和共焦小孔15滤除背景噪声，到达光电倍增管16。

本发明的实现的具体步骤如下：

第1步、分析仪器的噪声的物理抑制

采用物理方法抑制分析仪器噪声。具体步骤包括安装遮光布1和遮光板2阻挡外部杂散光，构建密闭箱3、保持实验室恒温通风环境避免内部杂散光，在摄影镜头位置安装遮光罩4和挡光环5可阻挡成像杂散光。

第2步、观察放大电路输出噪声

关闭光电倍增管，观察在光电倍增管后端的放大电路的输出端的噪声情况，其中输出数据通过数据采集卡7采集，并经由计算机软件得到噪声时域波形，得到时长为10秒的噪声均值。

第3步、观察光电倍增管输出噪声

将光电倍增管和放大电路经数据线连接，关闭激光器，将黑纸挡住光电倍增管光路。打开连接光电倍增管电源，测量输出噪声，得到时长为10秒的噪声均值。

第4步、观察未加分离电场时的静态噪声

4.1未加荧光染料

毛细管内未添加SYBR Green I荧光染料，只有缓冲溶液。开启激光器，不加分离电场，采集噪声波形，得到时长为10秒的噪声均值。

4.2加荧光染料

毛细管内填充含有SYBR Green I荧光染料的缓冲溶液，不加分离电场，采集噪声波形，得到时长为10秒的噪声均值。

第5步、观察加分离电场时DNA毛细管电泳引起的动态噪声

毛细管内填充SYBR Green I荧光染料的缓冲溶液，以100-1000碱基对DNA为分离对象，两端施加直流电压，DNA在毛细管电泳时引起动态噪声。

5.1改变分离电场强度时噪声特性

改变分离电场强度200V/cm、300V/cm、400V/cm、500V/cm、600V/cm、700V/cm、800V/cm，其他参数固定，观察DNA在毛细管电泳时引起动态噪声，得到时长为10秒的噪声均值和方差。

5.2改变缓冲溶液浓度时噪声特性

改变缓冲溶液浓度0.4％、0.6％、0.8％、1.0％，其他参数固定，观察DNA在毛细管电泳时引起动态噪声，得到时长为10秒的噪声均值和方差。

5.3改变缓冲溶液分子量时噪声特性

改变缓冲溶液分子量250K、720K、1300K，其他参数固定，观察DNA在毛细管电泳时引起动态噪声，得到时长为10秒的噪声均值和方差。

5.4改变毛细管类型时噪声特性

选用圆形截面毛细管的内径75μm、50μm，毛细管正方形内截面边长为50μm，，其他参数固定，观察DNA在毛细管电泳时引起动态噪声，得到时长为10秒的噪声均值和方差。

5.5改变毛细管有效长度时噪声特性

改变毛细管有效长度8cm、10cm、12cm，其他参数固定，观察DNA在毛细管电泳时引起动态噪声，得到时长为10秒的噪声均值和方差。

第6步、第2步到第5步噪声分析

6.1分析第2步到第4步静态噪声：

第2步放大电路输出噪声幅度均值主要集中在0.15mV。第3步光电倍增管输出端噪声的电平主要集中在2.5-10mV。第4步未加分离电场时的静态噪声时，未加荧光染料噪声均值为11mV；加荧光染料噪声的噪声均值为16mV。

因此，对于静态噪声部分，选择合适的物理部件，如噪声更小，精度更高的放大电路和光电倍增管。

6.2分析第5步动态噪声：

第5步加分离电场时DNA毛细管电泳引起的动态噪声时：

改变分离电场强度时噪声特性，噪声均值在0.2-0.45V，方差为0-0.035，电场强度与噪声均值、方差成正比关系，信噪比最佳的最优化分离电场强度以较低值200V/cm为宜；

改变缓冲溶液浓度时，噪声均值在0.2-0.45V，方差为0-0.035，HEC浓度与噪声均值、方差反比关系，信噪比最佳的缓冲溶液浓度以较高值1％为宜；

改变缓冲溶液分子量时，噪声均值为0.05-0.3V，方差为0-0.1，噪声均值、方差与HEC分子量成正比，信噪比最佳的缓冲溶液分子量以较低值250k为宜；

改变毛细管类型时，噪声均值为0.13-0.21V，方差为0-0.018，噪声均值和方差均与随着侧面积与截面积之比成反比，信噪比最佳时选用50μm圆形内径的毛细管为宜；

改变毛细管有效长度时，噪声均值、方差呈现随机性。毛细管有效长度的选择不影响信噪比最佳性。

因此，对于动态噪声部分，选择各种条件小噪声均值和方差均为较小的实验参数，作为最优毛细管电泳检测参数。

综上所述，毛细管电泳可应用于脱氧核糖核酸片段分离及测序、聚合酶链式反应产物鉴定和核酸定量。本发明以100～1000碱基对的脱氧核糖核酸作为分离对象，采用毛细管电泳荧光信号检测系统，利用电泳时噪声特性确定检测系统的最佳参数。主要给出直流电场下毛细管电泳荧光信号检测系统中的噪声特性。对不同分离电场强度、羟乙基纤维素溶液浓度和分子量、毛细管有效长度、毛细管内径形状等环节噪声特性进行分析，得到该检测系统中信噪比最佳的优化参数。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。