基于含有活性铜碳点的尿酸电化学传感器及其应用的制作方法

本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及基于含有活性铜的碳点电化学传感器及其应用，实现对尿酸的选择性灵敏检测。

背景技术：

尿酸是人体嘌呤的代谢产物，在人体中含量过高的话会导致痛风性关节炎、高尿酸血症和leshnyan综合症等疾病。近年来随着人们生活质量的提高，我国人民从食物中摄取的嘌呤含量提高，越来越多的人处于尿酸过高的亚健康状态甚至疾病状态。因此，人体内尿酸浓度的准确检测在临床诊断领域极为重要。

目前尿酸浓度的测定方法主要有色谱法、分光光度法、荧光法、化学发光法、电化学法。其中电化学方法具有选择性好、灵敏度高、操作简单和成本低廉等优点而广泛应用于尿酸的测定。然而现有技术电化学传感器检测尿酸的方法主要遇到两个问题：一方面，传统电极上其氧化电位与抗坏血酸的电位接近，容易受到抗坏血酸的干扰；另一方面，尿酸检测的灵敏度有限不能满足需求。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于解决现有技术中所存在的技术问题，提供一种基于含有活性铜碳点(cu-cds)的尿酸电化学生物传感器，将活性铜的选择性与碳点在提高灵敏度上面的贡献结合起来。最终实现对尿酸的选择性高灵敏检测，具有选择性好、高灵敏性稳定性且制备工艺简单、成本低等优点。

本发明提供的基于含有活性铜的碳点电化学传感器,采用以下方法步骤制备而成：

1)采用水热法一步合成含有活性铜碳点：

将富含羧基的高分子聚合物、含二价铜盐加入到反应容器中，然后加入50ml去离子水稀释，混合均匀后得到混合反应液；再将混合反应液倒入水热反应釜中，200～240℃下反应2～18h，得到混合液；将所得混合液13000rpm离心30分钟去除溶液中的大颗粒残渣；用分子量为500～3000d的透析袋透析10～30h以达到纯化的目的，最终在4℃下避光保存，得到含有活性铜碳点的溶液；

所述的含二价铜盐为cu(no3)2、cucl2、cuso4等；

所述的高分子聚合物为聚甲基丙烯酸钠(pmaa)、聚丙烯酸钠(paas)等；

所述的高分子聚合物与含二价铜盐的质量比为1：0.02～0.1；

所述的混合反应液中二价铜离子的浓度为1～10.2mg·ml^-1。

2)电化学生物传感器的制备：

①玻碳电极的预处理：分别用粒径为1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末配合麂皮打磨电极，在0.65mm(浓度范围在0.1mmol～1mmol内均可)k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]溶液中进行循环伏安表征，当氧化峰和还原峰的峰值差△ep＜75mv后，再依次用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗，最后用氮气吹干待用。

②电化学生物传感器的制备：采用三电极体系，以玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，将上述预处理过的玻碳电极置入步骤(1)制备的含有活性铜碳点的溶液中，利用电沉积法在0～2v的电位范围50～500mv/s的扫速下循环扫描2～20圈，从而制得基于含有活性铜碳点的电化学生物传感器。

本发明的另一个目的是提供上述基于含有活性铜碳点的电化学生物传感器，在检测尿酸上的应用，具体包括以下步骤：

1)以磷酸缓冲溶液作为底液，配置不同ph的尿酸待测液，将电化学生物传感器的三电极连接电化学工作站插入该溶液中，采用循环伏安法进行测试，得到具有电化学响应的循环伏安曲线，对比尿酸峰电流大小与ph的关系，找出最佳ph值。

2)以磷酸缓冲溶液作为底液，配置尿酸待测液，将电化学生物传感器的三电极连接电化学工作站插入该溶液中，改变扫描速度采用循环伏安法进行测试，得到具有电化学响应的循环伏安曲线，对比尿酸峰电流大小与扫描速度的关系，找出最佳扫速值。

3)以磷酸缓冲溶液作为底液，配置一系列最佳ph值下不同尿酸待测液，将电化学生物传感器的三电极连接电化学工作站插入待测液中，在最佳扫描速度下采用示差脉冲法进行测试，得到具有电化学响应特征峰的电压-电流工作曲线，从中获得浓度-峰电流关系的工作曲线。

与现有技术相比，本发明利用含有活性铜碳点这种纳米材料不仅具有碳点大的比表面积和高的电子传递速率，还具有活性铜对电极界面上基质的电子转移速率的促进作用以及对尿酸的非常强的选择性。基于此原理制备生物传感器，实现了对尿酸灵敏性、特异性和稳定性的测定。

附图说明

图1为基于cu-cds电化学传感器检测尿酸的实验原理示意图；

图2为cu-cds的荧光光谱和紫外可见吸收光谱(插图为cu-cds在紫外灯照射下的图片)；

图3为不同修饰电极的交流阻抗图谱；

图4为不同电极在尿酸溶液中的循环伏安图；

图5为ph对本实验的影响图；

图6为扫描速度对本实验的影响图；

图7为不同浓度的尿酸对本实验的影响图；

图8为不同浓度的尿酸与峰电流的线性关系图；

图9为该方法对多巴胺，抗坏血酸和尿酸的选择性对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的分析。

实施例1

基于含有活性铜的碳点电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

a、含有活性铜碳点的制备：采用水热法一步合成含有活性铜的碳点：首先称取2.5gpmaa和50mgcu(no3)2于烧杯中，加入50ml去离子水稀释，待混合均匀后倒入水热反应釜中，240℃反应9h。将所得产物13000rpm离心30分钟去除溶液中的大颗粒残渣。用分子量为1000d的透析袋透析12h以达到纯化的目的，最终在4℃下避光保存。采用荧光光谱和紫外可见吸收光谱对得到的含有活性铜碳点进行了表征，结果如图2所示。

b、玻碳电极的预处理：分别用粒径为1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末配合麂皮打磨电极，在0.65mmk3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]溶液中进行循环伏安表征，当氧化峰和还原峰的峰值差△ep＜75mv后，再依次用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗，最后用氮气吹干待用。

c、电化学生物传感器的制备：采用三电极体系，以玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，将上述预处理过的玻碳电极置入步骤1制备的含有活性铜的碳点溶液中，利用电沉积法在0～2v的电位范围100mv/s的扫速下循环扫描10圈，从而制得基于含有活性铜碳点的电化学生物传感器。

与实施例1相同的实验条件下，将电化学生物传感器置于铁氰化钾溶液中，在0.01～100khz的扫描频率范围内扫描，结果如图3所示。

与实施例1相同的实验条件下，将电化学生物传感器置于0.1mol/lpbs溶液(ph7.0)中，在-0.4～0.6的电位范围内进行，100mv/s的扫速下进行，记录相应的循环伏安图，结果如图4所示。

实施例2

将50mgcu(no3)2变为1500mgcu(no3)2,其他条件同实施例1制得基于含有活性铜碳点的电化学生物传感器。

实施例3

将50mgcu(no3)2变为36.4mgcucl2,其他条件同实施例1制得基于含有活性铜碳点的电化学生物传感器。

实施例4

将50mgcu(no3)2变为1092mgcucl2,其他条件同实施例1制得基于含有活性铜碳点的电化学生物传感器。

实施例5

将50mgcu(no3)2变为42.6mgcuso4,其他条件同实施例1制得基于含有活性铜碳点的电化学生物传感器。

实施例6

将50mgcu(no3)2变为1278mgcuso4,其他条件同实施例1制得基于含有活性铜碳点的电化学生物传感器。

实施例7

利用上述制备的传感器检测尿酸的浓度，如图1所示：

a、制备尿酸溶液：将购买的尿酸用磷酸盐缓冲溶液溶解，配制成浓度为100μmol/l的溶液，4℃保存待用；0.1mol/l磷酸盐缓冲溶液(pbs)的配制：用nah2po4，na2hpo4和kcl配制，并用0.10mol/lh3po4或naoh调节ph值，4℃保存待用。

b、玻碳电极的预处理：分别用粒径为1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末配合麂皮打磨电极，在0.65mmk3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]溶液中进行循环伏安表征，当氧化峰和还原峰的峰值差△ep＜75mv后，再依次用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗，最后用氮气吹干待用。

c、电化学生物传感器的制备：采用三电极体系，以玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，将上述预处理过的玻碳电极置入实施例1步骤a制备的含有活性铜的碳点溶液中，利用电沉积法在0～2v的电位范围100mv/s的扫速下循环扫描10圈，从而制得基于含有活性铜的碳点的电化学生物传感器。

d、以磷酸缓冲溶液(ph＝7.0)作为底液，配置一系列不同浓度的尿酸待测液，将上述电化学生物传感器连接电化学工作站插入待测液中，通氮除氧，在100mv/s的扫描速度下采用示差脉冲法进行测试(参数为：扫描速率50mv/s，增幅0.05v，脉冲宽度0.05s，扫描范围-0.12～0.25v)。测得的峰电流与浓度建立线性关系(图7和图8)，然后相同条件下实验，测量未知浓度尿酸的峰电流，根据建立的浓度-峰电流关系工作曲线得出尿酸的浓度。

实施例8

改变缓冲溶液的ph值，其他步骤同实施例2，ph值对本实验的影响如图5所示；

改变扫描速度，其他步骤同实施例2，扫描速度对本实验的影响如图6所示；

实施例9

将检测对象尿酸分别改为抗坏血酸和多巴胺，在同实验例2相同的条件下，结果如图9所示。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。