本发明涉及的是一种分子印迹传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种原花青素分子印迹传感器的制备方法，具体是基于分子印迹特异性识别作用，用于检测药品、食品、生物样品中的原花青素技术。
背景技术：
原花青素，简称opc，其分子式为c30h12o6，相对分子质量为468.24，是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。一般为红棕色粉末，气微、味涩，溶于水和大多有机溶剂。最新研究表明蓝莓叶提取物原花青素可阻止丙肝病毒复制。是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。一般为葡萄籽提取物或法国海岸松树皮提取物。原花青素（葡萄籽提取物）是一种新型高效抗氧化剂，是目前为止所发现的最强效的自由基清除剂，具有非常强的体内活性。实验证明，opc的抗自由基氧化能力是维生素e的50倍，维生素c的20倍，并吸收迅速完全，口服20分钟即可达到最高血液浓度，代谢半衰期达7小时之久。
原花青素可以清除细胞膜中水溶性和脂溶性的自由基，因此，抑制了释放某些酶去伤害毛细血管壁的过程。原花青素也已经用来防止糖尿病患者白内障手术后的并发症。因为它能恢复胶原蛋白活力，使皮肤平滑而有弹性。胶原蛋白是皮肤的基本成份，并且是一种使我们身体成为一个整体的胶状物质。维生素c是生化合成胶原蛋白必要的营养品。原花青素使更多的维生素c生效，这意味着，维生素c可以更容易地去完成它所有功能（包括胶原蛋白产生）。原花青素连接在胶原蛋白上，可以阻止那些破坏胶原蛋白的酶的危害。原花青素不仅帮助胶原蛋白纤维形成交联结构，而且可以帮助恢复因受伤和自由基所引起的过度交联的损害。过度交联会使结缔组织窒息和硬化，从而使皮肤起皱纹和过早老化。花青素还保护人体免受阳光伤害，促进治愈牛皮癣和寿斑。原花青素也是局部施用的皮肤霜的极好添加剂。原花青素加快了有害的胆固醇的分解和排除。原花青素使关节灵活、可以修复结缔组织内的胶原蛋白，以及减轻水肿。还有报道，原花青素改善许多人的关节炎症。原花青素还改善了毛细血管状态，增强流向大脑的血液循环，因此，大脑可得到更多的氧。
目前，检测原花青素的方法主要有高效液相色谱、液相色谱-质谱，色谱法的准确度受到一定限制、而且仪器比较贵需要专业人员操作，也限制了其应用。也可用分光光度计快速测定，其干扰组分影响很大，给光度分析带来较大误差。另外，由于原花青素与黄酮类分子结构十分相近很难分开，测定时互相干扰，准确检测原花青素很困难。因此，找到一种选择性好、灵敏度高、操作简便使用的检测原花青素的方法十分有意义。
分子印迹技术是当前开发具有分子识别功能的高选择性材料的主要方法之一，它是通过在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在分子印迹聚合物的网络结构中留下具有结合能力的识别位点，对模板分子表现出高选择识别性能的一种技术。这项技术以其构效预定性和特异识别性越来越受到人们的关注，已经成功用于固相萃取或微固相萃取，亲和色谱或毛细管电泳及传感器等领域。
依据此技术制备的分子印迹传感器，应用于药物分析、环境保护及生命科学研究中起着十分重要的作用。将功能分子以适当方式修饰到电极上，制备选择性好、灵敏度高、有一定使用寿命可再生的电化学传感器成为分析科学工作者努力探索的课题。但是传统的印迹方法所制备的印迹膜厚度难以控制，高交联度使得电子传递速度和响应慢、检测下限高而且再生和可逆性差，影响分子印迹技术在电化学传感器中的应用。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对研究人员、生产企业、质控人员、进出口商检、政府管理部门等的迫切需要的，对食品、药品、环境安全中的原花青素含量准确定量测定十分必要，对于原花青素生产和药理研究也具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种原花青素分子印迹传感器的制备方法，主要是以原花青素为模板，在玻碳电极表面通过氧化石墨烯、纳米铂粒子的修饰，提高了传感器的灵敏度，采用滴涂法制制备花青素分子印迹传感器。
仪器与试剂
chi660b电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，ag/agcl为参比电极（sce），玻碳电极（gce）为工作电极；kq-250e型超声波清洗器（坤峰超声仪器有限公司）。
氧化石墨烯；偶氮二异丁酸二甲酯、乌头酸；1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐，偶氮二异庚腈，无水乙醇；原花青素；氯铂酸；动物胶；磷酸缓冲溶液；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种原花青素分子印迹传感器的制备方法，特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）石墨烯铂修饰液制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，去离子水：90~94%，氯铂酸：1.0~3.0%，氧化石墨烯：4~8%，室温下超声15min，分散均匀，得到石墨烯纳米铂修饰液；
（2）石墨烯纳米铂修饰玻碳电极制备：将玻碳电极依次用0.2μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，吹干，在玻碳电极表面滴加20~25μl石墨烯铂修饰液，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得石墨烯纳米铂修饰玻碳电极；
（3）原花青素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，去离子水：56~66%，甲基丙烯酸羟乙酯：6~10%，甲叉琥珀酸：6~10%，1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐：12~20%，偶氮二异丁酸二甲酯：1.0~4.0%，原花青素：0.5~2.0%，各组分含量之和为百分之百，搅拌溶解，通氮气体除氧15min，无氧氛围，75±2℃搅拌反应6~8h，将得到的产物用甲醇：乙酸体积比为10:1混合溶液浸泡12~15h，除去模板分子，干燥，即得原花青素分子印迹聚合物；
（4）原花青素分子印迹传感器的制备方法：取适量的原花青素分子印迹聚合物分散于1%的动物胶溶液中，制得25g/l的原花青素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液12~15μl滴加到步骤（2）制备的石墨烯纳米铂修饰玻碳电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得原花青素分子印迹传感器。
在步骤（1）中所述的氯铂酸与氧化石墨烯的质量比为1：3最优。
在步骤（3）中所述的甲叉琥珀酸与1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐摩尔比为1：1最优。
在步骤（3）中所述的1-丙烯基-3-甲基咪唑溴盐与甲基丙烯酸羟乙酯摩尔比为1：1最优。
本发明的优点及效果是：
本发明将印迹技术、层层自组装法和滴涂法相结合，在氧化石墨烯与纳米铂修饰玻碳电极表面成功地研制了一种具有特异选择性的印迹电化学传感器。通过与无氧化石墨烯纳米铂修饰的分子印迹电极那个的响应进行比较，本发明制备的原花青素分子印迹传感器的响应大大提高。该印迹传感器对原花青素表现出较高的亲和性和选择性，响应电流与原花青素的浓度在1.0×10-8~2.0×10-4mol/l范围内呈良好的线性关系，检测限为9.26×10-9mol/l将本发明制备的原花青素分子印迹传感器成功用于药品、食品、生物样品中原花青素的检测中，回收率在96.12~104.48%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药、食品、环保检测等相关领域。
具体实施方式
实施例1
（1）石墨烯铂修饰液制备：在反应器中，分别加入，去离子水：92ml，氯铂酸：2g，氧化石墨烯：6g，室温下超声15min，分散均匀，得到石墨烯纳米铂修饰液；
（2）石墨烯纳米铂修饰玻碳电极制备：将玻碳电极依次用0.2μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，吹干，在玻碳电极表面滴加23μl石墨烯铂修饰液，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得石墨烯纳米铂修饰玻碳电极；
（3）原花青素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：60ml，甲基丙烯酸羟乙酯：8g，甲叉琥珀酸：8g，1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐：18g，偶氮二异丁酸二甲酯：4g，原花青素：2g，搅拌溶解，通氮气体除氧15min，无氧氛围，75±2℃搅拌反应7h，将得到的产物用甲醇：乙酸体积比为10:1混合溶液浸泡13h，除去模板分子，干燥，即得原花青素分子印迹聚合物；
（4）原花青素分子印迹传感器的制备方法：取适量的原花青素分子印迹聚合物分散于1%的动物胶溶液中，制得25g/l的原花青素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液14μl滴加到步骤（2）制备的石墨烯纳米铂修饰玻碳电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得原花青素分子印迹传感器。
实施例2
（1）石墨烯铂修饰液制备：在反应器中，分别加入，去离子水：94ml，氯铂酸：1g，氧化石墨烯：5g，室温下超声15min，分散均匀，得到石墨烯纳米铂修饰液；
（2）石墨烯纳米铂修饰玻碳电极制备：将玻碳电极依次用0.2μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，吹干，在玻碳电极表面滴加20μl石墨烯铂修饰液，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得石墨烯纳米铂修饰玻碳电极；
（3）原花青素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：65ml，甲基丙烯酸羟乙酯：6g，甲叉琥珀酸：6g，1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐：20g，偶氮二异丁酸二甲酯：2g，原花青素：1g，搅拌溶解，通氮气体除氧15min，无氧氛围，75±2℃搅拌反应6h，将得到的产物用甲醇：乙酸体积比为10:1混合溶液浸泡14h，除去模板分子，干燥，即得原花青素分子印迹聚合物；
（4）原花青素分子印迹传感器的制备方法：取适量的原花青素分子印迹聚合物分散于1%的动物胶溶液中，制得25g/l的原花青素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液13μl滴加到步骤（2）制备的石墨烯纳米铂修饰玻碳电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得原花青素分子印迹传感器。
实施例3
（1）石墨烯铂修饰液制备：在反应器中，分别加入，去离子水：90ml，氯铂酸：3g，氧化石墨烯：7g，室温下超声15min，分散均匀，得到石墨烯纳米铂修饰液；
（2）石墨烯纳米铂修饰玻碳电极制备：将玻碳电极依次用0.2μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，吹干，在玻碳电极表面滴加25μl石墨烯铂修饰液，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得石墨烯纳米铂修饰玻碳电极；
（3）原花青素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：56ml，甲基丙烯酸羟乙酯：10g，甲叉琥珀酸：10g，1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐：19g，偶氮二异丁酸二甲酯：3g，原花青素：1.5g，搅拌溶解，通氮气体除氧15min，无氧氛围，75±2℃搅拌反应8h，将得到的产物用甲醇：乙酸体积比为10:1混合溶液浸泡12h，除去模板分子，干燥，即得原花青素分子印迹聚合物；
（4）原花青素分子印迹传感器的制备方法：取适量的原花青素分子印迹聚合物分散于1%的动物胶溶液中，制得25g/l的原花青素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液12μl滴加到步骤（2）制备的石墨烯纳米铂修饰玻碳电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得原花青素分子印迹传感器。
实施例4
（1）石墨烯铂修饰液制备：在反应器中，分别加入，去离子水：93ml，氯铂酸：2.5g，氧化石墨烯：4.5g，室温下超声15min，分散均匀，得到石墨烯纳米铂修饰液；
（2）石墨烯纳米铂修饰玻碳电极制备：将玻碳电极依次用0.2μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，吹干，在玻碳电极表面滴加22μl石墨烯铂修饰液，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得石墨烯纳米铂修饰玻碳电极；
（3）原花青素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：66ml，甲基丙烯酸羟乙酯：9g，甲叉琥珀酸：9g，1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐：12g，偶氮二异丁酸二甲酯：3g，原花青素：1g，搅拌溶解，通氮气体除氧15min，无氧氛围，75±2℃搅拌反应7h，将得到的产物用甲醇：乙酸体积比为10:1混合溶液浸泡15h，除去模板分子，干燥，即得原花青素分子印迹聚合物；
（4）原花青素分子印迹传感器的制备方法：取适量的原花青素分子印迹聚合物分散于1%的动物胶溶液中，制得25g/l的原花青素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15μl滴加到步骤（2）制备的石墨烯纳米铂修饰玻碳电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得原花青素分子印迹传感器。
实施例5
将上述实施例1~4所制备的原花青素分子印迹传感器，用于原花青素的检测，步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的原花青素标准溶液，底液为ph6.8的磷酸盐缓冲溶液；
（2）工作曲线绘制：将ag/agcl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的电极为工作电极组成三电极系统，连接chi660b电化学工作站，在k3[fe(cn)6]溶液中，采用循环伏安法在-0.40~0.6v电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为i0，含有不同浓度的花青素标准溶液的响应电流即为ii，响应电流降低的差值为△i=i0-ii，△i与原花青素标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制△i~c工作曲线；
（3）原花青素的检测：用待测样品代替步骤（1）中的原花青素标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△i和工作曲线，得到待测样品中原花青素的含量；
所述k3[fe(cn)6]溶液的浓度为10mmol/l；
所述ph6.8的磷酸盐缓冲溶液的浓度在80mmol/l。
该印迹传感器对原花青素表现出较高的亲和性和选择性，响应电流与原花青素的浓度在1.0×10-8~2.0×10-4mol/l范围内呈良好的线性关系，检测限为9.26×10-9mol/l将本发明制备的原花青素分子印迹传感器成功用于药品、食品、生物样品中原花青素的检测中，回收率在96.12~104.48%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药、食品、环保检测等相关领域。