一种利用双信号技术的电化学DNA生物传感器及其制备方法和应用方法与流程

本申请涉及一种利用双信号技术的电化学dna生物传感器及其制备方法和应用方法，属于化学检测及生物传感技术领域。

背景技术：

三核苷酸重复序列扩增是三核苷酸重复序列的拷贝数在世代传递中逐渐增加的一种基因动态突变。现已发现近30种疾病的发生与这一突变相关，包括弗里德里希共济失调，强直性营养不良，脊髓小脑性共济失调，脆性x综合征和肯尼迪氏病等。cag三核苷酸重复序列属于三核苷酸扩增性疾病中的一种，目前发现有14种神经变性的人类病症与cag/ctg三核苷酸重复(tnr)相关，包括脊髓小脑共济失调，脊髓性肌肉萎缩症，脆性x染色体综合征和亨廷顿病等。脆性x综合症是最为普遍的遗传智障疾病，男性患病率为1/2000，女性患病率为1/2500。因此三核苷酸重复序列的分析检测对于这类遗传疾病的早期诊断和预测有着非常重大的意义

三核苷酸重复序列目前的检测方法主要有凝胶电泳法，荧光法，差示扫描量热法等，然而这几种方法操作复杂、费时、敏感度低。因此，开发灵敏、简单的三核苷酸重复序列检测方法仍然是非常有意义的。由于电化学方法具有操作简便、快速、高灵敏度和通用性等诸多优点，近年来电化学分析技术在核苷酸的检测中已经获得了很重要的地位。

鉴于电化学方法的诸多优点，因此开发一种快速、简便而灵敏的电化学方法来检测三核苷酸重复序列是非常必要的。

技术实现要素：

本申请的目的在于提供一种利用双信号技术的电化学dna生物传感器。

为了实现上述目的，本申请采用如下技术方案：

一种利用双信号技术的电化学dna生物传感器，提出了双信号技术，能够特异性的检测分析三核苷酸重复序列的序列和确定重复数目。以金电极作为基底电极，利用金硫键作用将巯基化sh-dna-fc电化学分子信标探针修饰到基底电极上，捕获辣根过氧化酶标记的报告dna-目标dna杂交复合物，以辣根过氧化酶和二茂铁作为电化学双信号，对目标物进行分析检测。

利用双信号技术电化学dna生物传感器的制备和进行核酸检测的方法。

为了实现上述目的，本申请采用如下技术方案：

一种利用双信号电化学dna生物传感器的制备和应用方法，所述方法包括如下步骤：

(1)dna溶液的配制：用tris-hcl缓冲液将sh-dna-fc配制成浓度为0.5μm的sh-dna-fc探针溶液，用tris-hcl缓冲液将生物素修饰的dna即报告dna配制成浓度为2μm的报告dna溶液；所述sh-dna-fc的序列为5’-sh-(ch2)6-gcagtgcatgctcgtagtcgcact-fc-3’；所述生物素修饰的dna的序列为5’-ctgctgctgctgctgtttttt-biotin-3’；

(2)sh-dna-fc探针修饰金电极的制备：将金电极浸泡在步骤(1)所述的sh-dna-fc探针溶液中进行探针修饰，得到修饰完的金电极；将所述修饰完的金电极进行封闭，得到所述的sh-dna-fc探针修饰金电极；

(3)dsdna修饰的金电极的制备：将步骤(2)所得到的sh-dna-fc探针修饰金电极浸泡在含有目标dna和报告dna的溶液中，反应后，即得dsdna修饰的金电极；

(4)双信号电化学dna生物传感器工作电极的制备：将链霉亲和素修饰的辣根过氧化酶滴加至步骤(3)制备的dsdna修饰的金电极表面上，杂交反应后，得到酶标记的dsdna修饰的金电极，即双信号电化学dna生物传感器工作电极；

(5)检测底液的制备：取pb缓冲溶液、双氧水和tmb溶液加入到检测池中，混合均匀即得到检测底液；

(6)双信号电化学dna生物传感器的信号检测：将步骤(4)得到的双信号电化学dna生物传感器工作电极、饱和甘汞电极和铂电极构成三电极体系插入上述步骤(5)制备的检测底液中，进行检测。

优选地，步骤(1)中，tris-hcl缓冲液为三(羟甲基)氨基甲烷溶液，其浓度为0.1m,调节ph至7.4。

优选地，步骤(2)中，在进行探针修饰时，反应温度为20～35℃，修饰反应的时间为10～16小时；优选所述的修饰反应时间为12小时。

优选地，步骤(2)中，所述封闭是指使用浓度为1mm的巯基己醇进行封闭。

优选地，步骤(3)中，反应的温度为37℃，反应时间为1小时。

优选地，步骤(3)中，所述报告dna溶液的浓度为1.5～3μm。

优选地，步骤(4)中，反应温度为20～37℃，反应时间为0.5～1小时；所述链霉亲和素修饰的辣根过氧化酶，浓度为1～3μm。

优选地，步骤(5)中，检测底液的制备具体包括：分别取4ml的0.1mpb缓冲溶液、10μl的双氧水和10μl的tmb溶液加入到检测池中，混合均匀即得到检测底液。

优选地，所述的检测用于检测三核苷酸重复序列。

优选地，所述的检测方法包括电化学测定；选用chi660e型电化学工作站，利用循环伏安法、电化学阻抗、方波伏安法和电流-时间法进行扫描，根据电化学信号数据绘制标准曲线图；利用酶催化信号与二茂铁信号的比值，可以检测出d(cag)n的浓度，以及其n值的大小。

优选的是，在上述步骤(2)之前还包括对金电极进行预处理，即分别用0.05μm的al2o3粉末抛光打磨电极至镜面，再用无水乙醇和超纯水超声清洗，之后n2吹干备用。

优选地，上述步骤(5)中0.1mpb缓冲溶液采用0.2m的na2hpo4溶液和0.2m的kh2po4溶液混合后调节ph至5.0得到。

本申请中，利用二茂铁标记的电化学分子信标和辣根过氧化酶标记的报告dna，构建了一种新型的双信号电化学传感器检测三核苷酸重复序列d(cag)n。通过利用dna对电极进行一系列的修饰，构建了一个双信号电化学传感器。利用电化学分子信标发卡型的dna作为捕获探针，当目标物存在时，发卡型dna被打开，二茂铁信号的强度发生改变，因此可以利用二茂铁信号的变化来测定目标物的浓度。酶催化信号的变化与三核苷酸重复的n值有关，利用双信号强度的比值可以测定n值的数目。上述传感器对三核苷酸重复序列的检测显示出卓越的电催化活性，宽的线性范围和较低的检测限，提供了一种高灵敏度、高特异性、操作方法简便的检测方法。

本申请所述的方法对cag重复序列具有优秀的选择性和灵敏度，检测范围为1pm-100nm，并且具有良好的线性关系，检测限为0.15pm。更为重要的是，通过两种信号的比值分析，发现h/f值与重复序列n值具有良好的线性关系，可实现重复数目的检测诊断。

本申请的优点与效果是：

本申请中提出了双信号技术，能够特异性的检测分析三核苷酸重复序列的序列和确定重复数目。以金电极作为基底电极，利用金硫键作用将巯基化sh-dna-fc电化学分子信标探针修饰到基底电极上，捕获辣根过氧化酶标记的报告dna-目标dna杂交复合物，以辣根过氧化酶和二茂铁作为电化学双信号，对目标物进行分析检测。

本申请主要利用电化学方法分析检测三核苷酸重复序列d(cag)n，利用双信号技术和核酸杂交构建了简单便捷、稳定性高的电化学传感体系，结果表明具有很好的线性范围，检测限较低，并具有优秀的选择性。更为重要的是利用双信号技术可较为准确地分析信号与重复数目之间的关系，检测出重复数目n值。这些研究为d(cag)n重复序列的分析诊断提供了一种可行性较高的技术方案，也被期望用于神经遗传疾病中其它重复序列的检测。

附图说明

图1为本申请中的电化学传感器的原理示意图。

图2a是修饰目标dna前后二茂铁的方波伏安曲线图，图2b是修饰目标dna前后电流-时间曲线图。

图3为电化学传感对不同三核苷酸重复序列的选择性。

图4a为不同浓度的目标dna与二茂铁信号的线性关系图，图4b为不同浓度的目标dna与酶催化信号的线性关系图。

图5为具有不同n值的目标dna的线性关系图。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。

本申请提供一种快速、简便、低成本的新型电化学dna生物传感器，实现了对三核苷酸重复序列的快速检测。dna在裸金电极上自组装得到dna-ge电极，以二茂铁信号和辣根过氧化酶催化信号作为双信号，磷酸盐缓冲溶液(ph5.0，0.1m)为缓冲底液。该方法对三核苷酸重复序列的线性检测范围为1pm-100nm，可以实现对三核苷酸重复序列快速、简便、准确的定量检测。

实施例1

一种利用双信号电化学dna生物传感器进行检测的方法，所述方法包括如下步骤：

首先对金电极进行预处理，用0.05μm的al2o3粉末将金电极抛光打磨至镜面，再分别用无水乙醇和超纯水超声清洗5min,重复2-3次。再将电极置于0.5m的h2so4溶液中用循环伏安法连续扫描至稳定，得到了干净的裸金电极，记为ge。

(1)dna溶液的配制：用tris-hcl缓冲液(tris-hcl缓冲液为三(羟甲基)氨基甲烷溶液，其浓度为0.1m,调节ph至7.4)将sh-dna-fc配制成浓度为0.5μm的sh-dna-fc探针溶液，用tris-hcl缓冲液将生物素修饰的dna即报告dna配制成浓度为2μm的报告dna溶液；所述sh-dna-fc的序列为5’-sh-(ch2)6-gcagtgcatgctcgtagtcgcact-fc-3’；所述生物素修饰的dna的序列为5’-ctgctgctgctgctgtttttt-biotin-3’；

(2)将活化好的金电极浸入50μl，0.5μm的sh-dna-fc(其序列为：5’-sh-(ch2)6-gcagtgcatgctcgtagtcgcact-fc-3’)探针溶液中进行探针修饰，探针修饰反应时间为12小时，范围温度为25℃；之后，用超纯水淋洗，即可得到sh-dna-fc修饰的金电极sh-dna-fc|ge。之后将电极浸入在6-巯基己醇中，培育30min进行封闭。

将该步骤中得到的电极在ph＝7.4的磷酸缓冲溶液中，在0～0.7v范围内进行方波伏安法测定。

(3)dsdna修饰的金电极的制备：将目标dna与2μm的生物素修饰的报告dna(其序列为：5’-ctgctgctgctgctgtttttt-biotin-3’)混合，90℃下处理5分钟，进行互补配对，得到报告-dna|t-dna溶液；将步骤(2)所得到的sh-dna-fc探针修饰金电极浸泡在报告-dna|t-dna溶液中，在37℃反应1小时后，即得dsdna修饰的金电极；

将该步骤中得到的电极在ph＝7.4的磷酸缓冲溶液中，在0～0.7v范围内再次进行方波伏安法测定。(4)双信号电化学dna生物传感器工作电极的制备：将10μl链霉亲和素修饰的辣根过氧化酶滴加至步骤(3)制备的dsdna修饰的金电极表面上，室温下反应30min，之后用超纯水清洗得到酶标记的dsdna修饰的金电极，即双信号电化学dna生物传感器工作电极；立即进行电化学检测。

(5)检测底液的制备：分别取4ml的0.1mpb缓冲溶液、10μl的双氧水和10μl的tmb溶液加入到检测池中，混合均匀即得到检测底液。

(6)将上述步骤(4)得到的双信号电化学dna生物传感器工作电极电极浸入检测底液中，以铂丝电极为对电极，饱和甘汞为参比电极，记录电流-时间曲线进行检测。

实施例2

本实施例涉及电化学dna生物传感器对三核苷酸重复序列的选择性。

在本实施例中，我们选取了引起神经性遗传疾病常见的七种三核苷酸重复序列来进行选择性实验，七种dna分别为d(cag)15，d(ccg)15,d(ctg)15,d(att)15,d(tgg)15,d(gaa)15,d(cgg)15。实验中，目标dna为d(cag)15，浓度为100pm，而干扰dna浓度选十倍于目标dna浓度即1nm。如图3所示，目标dna表现出明显的电化学信号，然而其它三核苷酸重复序列(tgg，ccg，gaa，cgg，ctg，att)修饰的电化学传感器却没有明显的电化学信号。这些结果说明本发明中的双信号电化学传感器能够选择性识别cag三核苷酸重复序列。

实施例3

本实施例涉及对不同浓度的目标dna进行检测

本实例中，对不同浓度的目标dna进行了检测。结果表明在1pm-10nm浓度范围之间，辣根过氧化酶的酶催化电流信号随着目标dna浓度的增加而增加，然而当目标dna的浓度增加到100nm之后，其电流-时间响应值增加的比较缓慢，说明其传感捕获目标dna已经达到相应的饱和。用电信号-浓度关系研究，发现在1pm-100nm浓度范围内电流响应值的负数与目标物浓度的对数值具有良好的线性关系，如图4b所示，线性方程为i＝1.20599logc+4.93149，r²＝0.9993，传感器的检测限为0.15pm。其中i为测量的电流强度，c为目标物的浓度。图4a为不同浓度目标dna的二茂铁的变化值(δi)，δi＝i0-ic，其中i0为目标dna培育前的发夹型dna的二茂铁的信号值，ic为不同浓度的目标dna培育后将发夹型dna打开的二茂铁的信号值。在1pm-100nm浓度范围之间，随着目标dna浓度的增加，电化学分子信标会逐渐打开，其二茂铁电信号将会变小，通过研究二茂铁的信号变化值与目标物浓度关系，我们发现信号变化值与目标物浓度对数值也具有良好的线性关系，如图4a所示，线性方程为δi＝0.11576logc+0356，r²＝0.997，检测限为0.26pm。这些结果说明本申请中的双信号电化学传感器能够检测不同浓度的cag三核苷酸重复序列。

实施例4：

本实施例涉及cag三核苷酸重复序列中重复数目n值的测定

三核苷酸重复序列中重复数目特别难以检测，但是这样的测定在神经性疾病中又非常重要。所以检测三核苷酸重复序列的重复个数n值尤为重要，这里我们设计的双信号传感器是专门用于确定重复数的。

本实例中我们通过分析比较双信号的比值(h/f)来确定重复数目，h为酶催化的电信号，f为二茂铁的变化值。当电极表面上捕获一条目标dna时，一条发夹型dna将被打开。因此，二茂铁的信号变化和d(cag)n链的数目之间存在明确且直接的关系。在每条dna链中，重复数n越多，一个目标dna可以与更多的报告-dna进行互补配对，使得sa-hrp的信号越高。我们发现随着d(cag)15浓度的增加，h/f逐渐减小，当浓度在1nm-100nm范围内时，h/f值趋于稳定。所以选择10nm对重复数目n值进行h/f的研究。

实验中我们发现不同n值的d(cag)n的二茂铁的信号变化值f(n＝10,15,20,25,30,35)，随着重复n值的增加，f值趋于稳定。而不同n值的d(cag)n的电流响应值h，随着重复n值的增加，电流响应值的负数也在增加，并且电流响应值的负数与n值具有良好的线性关系。结果表明h值的变化趋势要远大于f值的变化趋势。如图5所示，我们比较了不同重复数n值的h/f比值关系，从图中可以看出，随着n值的不断增加，h/f也不断增加，并且h/f值与n值具有良好的线性关系，线性方程为h/f＝0.1398n+9.89788，r²＝0.974，n为(cag)n的重复个数。这些结果说明本申请中的双信号电化学传感器能够检测不同n值的cag三核苷酸重复序列。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。