本发明涉及动物疾病诊断领域，具体的说是一种可快速检测猪链球菌9型抗体的elisa诊断试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：：猪链球菌是一种具有荚膜的革兰氏阳性菌，可致败血症、猪脑膜炎、肺炎和突然死亡等症状，也可通过受损的皮肤黏膜而感染人类，严重可致人死亡，是一种重要的人畜共患传染病病原菌。根据其荚膜多糖抗原(cps)可将其分为35个血清型(1～34型和1/2型)，其中1型、2型、7型和9型是猪的致病菌。1998年和2005年分别在江苏和四川地区暴发人感染2型并致死亡的事件，危害严重。2005-2007年修福晓等分别从广东，上海，江苏，江西等地的病猪脑积液还有健康猪的扁桃体中分离检测到猪链球菌9型(streptococcussuistype9，ss9)。近些年来，在中国的发病猪中也经常分离出ss9且呈上升趋势，国内猪群除了2型外，9型也是重要的致病菌。目前，猪链球菌的毒力因子的研究大都集中于猪链球菌2型，猪链球菌9型的相关研究很少。因此，建立一种敏感、快速、特异的猪链球菌9型检测方法，对该病的预防、诊断和治疗具有非常重要的意义。猪链球菌血清学检测方法主要包括间接血凝试验、酶联免疫吸附试验(elisa)和补体结合试验。补体结合试验参与反应的成分多，操作步骤繁琐；间接血凝试验敏感性不高，容易产生自凝而使试验结果受到影响。由于间接elisa方法的敏感性高、特异性好，所以常用于血清学检测。目前，国内对猪链球菌的研究大多集中于2型，而对ss9抗体检测的研究相对匮乏。进口的猪链球菌9型抗体检测试剂盒价格十分昂贵且特异性不是很好，而国内市场又没有此类产品。与此同时，在ss9疫苗的研发过程中，经常用到猪，小鼠，兔子，豚鼠等多种动物，亟需要一种可以同时检测多种动物ss9抗体检测方法，来简化研发过程。而目前市面上，尚无此类产品。技术实现要素：发明目的：为解决现有技术中的问题，本发明的目的之一是提供一种特异性强、灵敏度高的猪链球菌9型抗体的ppa-elisa检测试剂盒；本发明的另一目的是提供上述检测试剂盒的制备方法。技术方案：本发明所述的猪链球菌9型抗体的ppa-elisa检测试剂盒，包括酶标二抗和猪链球菌9型抗原蛋白，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌a蛋白。进一步的，所述的猪链球菌9型抗体的ppa-elisa检测试剂盒还包括：阳性血清对照和阴性血清对照。进一步的，所述的猪链球菌9型抗体的ppa-elisa检测试剂盒还包括：酶标板、包被缓冲液、封闭液、底物液、洗涤液和终止液。所述的阳性血清对照、阴性血清对照来源于兔子。所述猪链球菌9型抗原蛋白由如下方法制备：将猪链球菌9型菌悬液接入培养基中培养一段时间后，离心洗涤后悬浮于培养基中，1～1.5×105pa高压10～20min，离心取上清液即得猪链球菌9型抗原蛋白。所述的包被缓冲液为0.04～0.06mol/l、ph9.5～9.7的碳酸盐缓冲液，优选为0.05mol/l、ph9.6的碳酸盐缓冲液。所述的封闭液为质量分数为4.5～5.5％优选为5％的脱脂奶粉溶液，溶剂为生理盐水。所述的底物液为opd-h2o2-磷酸盐缓冲液，具体配制方法为：用10ml底物液时准确称量4mg领苯二胺(opd)，溶解于5ml双蒸水后，取a液2.43ml和b液2.57ml加入，待充分溶解后加入30％过氧化氢20μl混匀，其中a液为0.1mol/l柠檬酸水溶液，b液为0.2mol/lna2hpo4·12h2o水溶液。所述的洗涤液为含质量分数0.05～0.06％吐温-20的pbs缓冲液，优选为含质量分数0.05吐温-20的pbs缓冲液。所述的终止液为2～2.5mol/lh2so4，优选为2mol/lh2so4。上述试剂配合使用可达到最佳的实验结果。本发明还提供了所述的猪链球菌9型抗体的ppa-elisa检测试剂盒的制备方法，包括：(1)制备猪链球菌9型抗原蛋白：将猪链球菌9型菌悬液接入培养基中培养一段时间后，离心洗涤后悬浮于培养基中，1～1.5×105pa高压10～20min，离心取上清液即得猪链球菌9型抗原蛋白；(2)配制试剂盒的其他试剂。步骤(1)中，每500ml培养基接入500～600μl所述的菌悬液，所述的培养基为thb培养基；培养时为震荡培养，培养温度为35～37℃，培养时间为16～18h；洗涤时采用pbs进行洗涤。步骤(1)中，高压的条件优选为1×105pa高压15min，高压后离心的转速为2900～3100r/min，时间为10～15min，优选的，转速为3000r/min，时间为10min。与现有技术相比，本发明的有益效果为：间接elisa试验快速和结果稳定，同时可以达到很高的灵敏度，同其他诊断技术相比，该方法更加适用于临床实践。本发明中试剂盒所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌a蛋白(spa)，spa不仅与血清igg的fc段有很强的结合力，同时还能与血清中少量的igm和iga结合，使本试剂盒很高的敏感性。本发明中试剂盒所用酶标二抗spa与用辣根过氧化物酶标记igg作为二抗相比，具有制备容易、性质稳定、易纯化、与抗原结合力强、易于被辣根过氧化物酶标记等优点，有助于提高试剂盒的保存期和利于其规模化组装生产。用酶标spa代替二抗建立ppa-elisa，可同时对豚鼠、家兔、猪血清进行检测，结果反应灵敏，避免了使用多种二抗造成的麻烦，缩短了反应时间，使用多种动物研发ss9疫苗提供了可靠的工具。本试验运用高压法处理抗原，不需要昂贵的仪器，处理步骤较为简单。本发明的试剂盒具有操作简单，检测快速、成本低廉等特点，体现了既继承传统又敢于创新的思想，适合于大量动物血清的普查，可在实际生产中广泛推广使用。附图说明图1ss9间接elisa结果阳性阴性颜色对比；图2本发明ppa-elisa的技术路线；图3猪链球菌9型菌株于血平板上复苏图片；图4考马斯亮蓝法测定蛋白含量标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。本发明具体实施方式所用材料如下：1、菌株猪链球菌9型(jzlq分035)菌株，于某地临床病猪分离出，由山东绿都生物科技有限公司提供，后于江苏农林职业技术学院动物疾病检测中心保存。2、实验动物家兔2只，90日龄，清洁级，每只2.0-2.5kg。试验前先用elisa方法检测下，结果其为猪链球菌9型阴性。单笼饲养，每顿喂饲料150g，一日喂食两次，观察一周，确保健康后使用。3、血清3.1阳性和阴性血清的制备选取两只健康兔子，实验前先用血凝实验检测兔子血清的ss9抗体，将血清为阴性的兔子选取为实验动物。经过检测，两只均可作为实验动物，一只准备制备阴性血清注射等量的pbs；另一只准备制备阳性血清。初免用加了弗氏完全佐剂的抗原，2ml/只肌肉注射；7天后用加了弗氏不完全佐剂的抗原肌肉注射，2ml/只；14天后肌肉注射不加佐剂的抗原，2ml/只；21天后静脉注射不加佐剂的抗原2ml/只，每次含菌量不低于2.75×107cfu/ml。在免疫的0、7、14、21、28天用间接elisa法实验检测，合格者耳静脉采血，采兔子血液后于常温20min左右待凝后放4℃过夜或37℃一小时至析出血清，无菌分离出血清后-80℃保存。3.2其他阳性血清口蹄疫、蓝耳、猪传染性胃肠炎、猪瘟阳性血清均购自韩国金诺(median)。4、主要仪器和设备表1实验仪器与生产厂家table1theexperimentalinstrumentsandmanufacturers5、主要试剂表2主要试剂及配制table2mainreagentsandsourcesofmanufacture实施例11、方法1.1菌种复苏从-80℃冰箱中取出保存的ss9菌种，打开超净台，点燃酒精灯，用75％的酒精消毒。用移液枪吸取2ml的thb培养基加入菌种管里，反复吹吸，混匀。吹打时枪头不能离开液面，防止产生气泡。烧环，挑取满一环菌液在血平板上划线，同时也吸取200μl的菌液加入另一个血平板上中央，防止血平板上的菌株没有复苏成功。做好标记，然后把两个血平板放入培养箱，37℃培养18h。1.2培养基的制备thb培养基：称取thb培养基36.4g，溶解于1000ml的蒸馏水中，用盐酸或氢氧化钠调ph至7.5-7.8，121℃高压灭菌15分钟，等温度降至60℃左右，加多粘菌素10mg和萘啶酮酸15mg，然后加入20ml的犊牛血清。绵羊血琼脂培养基：配置500ml大豆酪蛋白琼脂培养基(tsa)，将其高压灭菌后，冷却至50℃左右，以不烫手为宜。然后再在其中加入50ml脱纤维绵羊血，轻轻摇匀，立即倾注于灭菌的平板内，制成绵羊血琼脂平板备用。1.3无菌pbs的制备量800ml的蒸馏水，加氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，轻微摇晃，使其充分溶解，然后定容至1000ml。调节ph值为7.4。121℃高压灭菌15min，冷却后放入4℃冰箱备用。1.4考马斯亮蓝染色法相关试剂的制备考马斯亮蓝试剂：取100mg考马斯亮蓝g-250溶于50ml95％乙醇中，然后加入100ml85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。标准蛋白溶液：结晶牛血清蛋白，加0.15mol/lnacl配制成1mg/ml蛋白溶液。1.5elisa相关试剂的制备1.5.1包被缓冲液：0.05mol/l、ph9.6的碳酸盐缓冲液(carbonatebuffersolution,简称cbs)，配制时取1.59gna2co3、2.93gnahco3，然后加去离子水至1000ml，调ph值至9.6，室温贮藏。1.5.2洗涤液：pbst，含0.05％吐温-20的0.01mol/l、ph7.4的磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsolution，简称pbs)。1.5.3封闭液：5％脱脂奶粉溶于生理盐水。1.5.4底物液：即opd-h2o2-磷酸盐缓冲液，用10ml底物液时准确称量4mg领苯二胺(opd)，溶解于5ml双蒸水后，取a液2.43ml和b液2.57ml加入，待充分溶解后加入30％过氧化氢20μl混匀a液(0.1mol/l柠檬酸液)：称柠檬酸19.2g，加蒸馏水至1lb液(0.2mol/lna2hpo4·12h2o溶液)：称磷酸氢二钠17.7g，加蒸馏水至1l时。1.5.5终止液：即2mol/lh2so4，100ml浓硫酸缓慢加入ml双蒸水，并不断搅拌。1.6菌悬液的制备挑单个复苏好的菌落于5ml的thb培养基中，37℃震荡培养8h，吸取500μl加入500ml的thb培养基中，37℃震荡培养16h到达稳定期，离心机5000r/min离心10分钟，然后用无菌pbs(ph＝7.3)洗两遍，使细菌颗粒再悬浮在thb培养基中。最终的菌悬液用血平板活菌计数以精确地确定每毫升菌悬液的细菌数。1.7活菌计数将最终的菌悬液用灭菌pbs以1:10倍比稀释10个梯度。取后三个梯度的菌液各100μl涂布于干燥绵羊血平板中，用高压灭菌后的涂布棒将菌液在平板上涂布均匀。每个稀释度的菌悬液做两个血平板，并做一个无菌pbs和一个原液血平板对照，然后将平板放在超净台上10min左右，旨在使菌液充分渗透到培养基内。然后倒转放入37℃培养箱培养22小时左右，数菌落数，以出现20-300个菌落数的稀释度的平板为标准。计算公式：每毫升菌液中的细菌数＝同一稀释度平均菌落数×10×稀释倍数。1.8ss9灭活疫苗的制备参照1.1、1.6和1.7的操作步骤做出合适的菌悬液，加甲醛灭活，制备ss9灭活疫苗。细菌含量不低于2.75×107cfu/ml。1.9间接elisa检测方法的建立1.9.1包被抗原的制备及含量的测定吸取500μl上次保种的菌悬液加入500ml的thb培养基中，37℃震荡培养16h，离心机5000r/min离心10分钟，然后用无菌pbs(ph＝7.3)洗两遍，使细菌颗粒再悬浮在thb培养基中，1×105pa高压15min。3000r/min离心10min，取上清液。此为抗原标准原液，提取的抗原用考马斯亮蓝染色法进行蛋白含量的测定，制作标准曲线。分装制备好的抗原，保存于-20℃备用。取干净试管若干，在1至7号管中加入试剂(见表3)，标准蛋白溶液为结晶牛血清蛋白，染色液为考马斯亮蓝g-250，将加好的试剂倒入洗净的比色皿，测定吸光度a595，再取一管加抗原样品溶液0.5ml，染色液5ml，倒入洗净比色皿，测出抗原样品od595nm值。以1至7号管的标准蛋白浓度为横坐标，a595的od值为纵坐标绘制标准曲线(要求标准曲线的r2值不低于0.99)，根据所测抗原样品od595nm值，即可在标准曲线上查得相应的抗原浓度。表3考马斯亮蓝法检测蛋白含量table3detectionofproteinbycoomassiebrilliantbluecontent1.9.2抗原最适包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定采用方阵滴定法，用0.05mol/l碳酸盐缓冲液(包被缓冲液)将ss9抗原蛋白按1：21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26比例稀释，分别加入到包被板中，每孔100μl，4℃包被过夜；次日洗涤和封闭后，将阴性血清和阳性血清分别稀释为1:2、1:4、1:8、1:16四个浓度，包被于以上反应孔中，其他反应条件不变进行elisa反应，比较od450nm值并计算出p/n值，确定好最适的抗原浓度和血清稀释倍数。1.9.3抗原最适包被时间的选择以最佳抗原浓度包被酶标板，100μl/孔，将抗原包被时间分成4组：第一组：放4℃中过夜；第二组：37℃中包被2h；第三组：37℃包被1h后4℃过夜；第四组：常温1小时后4℃过夜。每组各重复三孔取平均值，其他条件不变重复进行两次elisa反应，在微孔分光光度计上读出od450nm值，比较阴性血清和阳性血清的od450nm值以及p/n值，确定最佳包被条件。1.9.4最佳封闭时间的确定使用优化后的最佳包被条件包被酶标板，做三个封闭时间的不同处理，分别37℃封闭60min、90min、120min，每个处理重复三孔取平均值，其他条件不变重复进行三次elisa反应，在酶联检测仪上读出od450nm值，比较阴性血清和阳性血清的od450nm值以及p/n值，以确定合适的封闭时间。1.9.5血清最佳反应时间的确定在最适抗原浓度以及最佳抗原包被条件下，封闭选用最适条件，使用最适稀释倍数的ss9阴阳性血清后，将血清反应时间做四个不同处理。分别于37℃反应30min、60min、90min、120min进行elisa检测，每个处理重复三孔取平均值，重复做三次，根据od450nm值和p/n值确定血清的最佳反应时间。1.9.6酶标二抗反应浓度及最佳作用时间的确定在最适抗原浓度以及最佳抗原包被条件下，封闭选用最适条件，使用最适稀释倍数的ss9阴阳性血清后，将酶标二抗辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌a蛋白(hrp-spa)稀释成6个浓度：1：1000；1:2000、1：4000、1:6000、1：8000、1:10000倍稀释，并将酶标二抗的反应时间分成4组，37℃分别反应30min、60min、90min、120min，进行elisa检测，根据od450nm和p/n值确定酶标二抗的最佳浓度和最佳作用时间。1.9.7底物反应时间的确定在最适抗原浓度以及最佳抗原包被条件下，封闭选用最适条件，使用最适稀释倍数的ss9阴阳性血清后，将底物反应时间分为四组，第一组：37℃反应5min；第二组：37℃反应15min；第三组：室温反应5min；第四组：室温反应15min，每组重复三孔取平均值，重复两次，加终止液终止反应并根据od450nm和p/n值确定最佳底物反应时间。1.10特异性实验利用建立的间接elisa操作程序，分别对口蹄疫、蓝耳、猪传染性胃肠炎、猪瘟阳性血清和猪链球菌9型阳性血清进行检测，然后进行特异性评价。1.11血清保质期实验将ss9阳性血清和阴性血清保存于-80℃中，分别于1天后、7天后、14天后、21天后、28天后取出按照建立的间接elisa检测方法进行实验，每次检测3个阳性血清和3个阴性血清，比较各血清样品的od450nm值和p/n值。2结果2.1菌株复苏后菌落形态和细菌形态将菌株划线于绵羊血琼脂平板，置于37℃恒温培养24h后观察菌落形态。观察到湿润光滑，边缘整齐的直径约为1mm的灰绿色小菌落，菌落周围呈β溶血(见图3)。经革兰氏染色后镜检，观察到革兰氏阳性菌呈短链状排列，个数大约为3-7个为一条链。2.2ss9活菌计数结果制备ss9抗血清时，用thb培养基培养ss9活菌计数结果为2.75×107cfu/ml，对家兔进行免疫，制作阳性血清。2.3考马斯亮蓝法测定蛋白结果利用考马斯亮蓝实验绘制出标准曲线(见图4)，按od值＝95.148co+0.0049公式计算，蛋白含量为0.188mg/ml。2.4判定标准结果计算数平均值(x)和标准差(sd)得到x＝0.5342、sd＝0.1237，故x+3sd＝0.9053，因此把0.9053作为阴性血清的上限，得到elisa的判定标准，即od450nm值＞0.9053，判为阳性，od450nm值＜0.9053则为阴性。2.5间接elisa最佳反应条件2.5.1抗原最适包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定包被elisa的抗原浓度为0.188mg/ml，对包被酶标板的抗原做4倍稀释，即浓度为47μg/ml，血清做8倍稀释时od450nm值为2.845，最高，p/n值为6.510，最大。故ss9的最佳包被浓度为47μg/ml，最佳血清稀释度为8倍稀释(见表4)。表4抗原最适包被浓度和血清最佳稀释倍数结果table4mostsuitableantigencoatedbestconcentrationsandserumdilutionresults2.5.2抗原最佳包被时间将抗原包被时间分成4组。第一组：4℃过夜。第二组：37℃包被2h。第三组：37℃包被1h后4℃过夜。第四组：常温1小时后4℃过夜。第一组两次重复od450nm值为2.245和2.334，数值最高。p/n值分别为5.045和5.651，比值最大。结果表明最佳包被时间是4℃过夜(见表5)。表5抗原最佳包被时间结果table5antigenbestcoatingresults2.5.3最佳封闭时间的确定将抗原做三个封闭时间的不同处理，37℃分别封闭60min、90min、120min，重复三次，三次重复120min条件下od450nm值为2.312、2.777和2.590，同一批次内数值最高。p/n值分别为4.242、4.863和5.201，同一批次内比值最大。结果表明最佳封闭时间是37℃封闭120min(见表6)。表6最佳封闭时间结果table6besttimetoclosetheresults2.5.4血清最佳反应时间的确定将血清反应时间做四个不同处理。37℃分别反应30min、60min、90min、120min反应，重复三次，三次重复60min条件下od450nm值为1.998、1.812和2.296，同一批次内数值较高。p/n值分别为5.444、4.576和5.627，同一批次内比值最大。结果表明血清最佳反应时间是60min(见表7)。表7血清最佳反应时间结果table7serumthebestreactiontimeresults2.5.5酶标二抗反应浓度及最佳作用时间的确定将酶标二抗稀释成6个浓度：1：1000、1:2000、1：4000、1:6000、1：8000、1:10000倍稀释，并将酶标二抗的反应时间分成4组，37℃分别反应30min、60min、90min、120min反应，1:1000浓度于37℃反应30min条件下p/n值为7.569，比值最高。结果表明酶标二抗最佳反应浓度是1：1000，最佳作用时间是37℃反应30min(见表8)。表8酶标二抗反应浓度及最佳作用时间结果table8concentrationandenzymelabeledsecondaryantibodyresponsetimeresults2.5.6底物反应时间的确定将底物反应时间分为四组，第一组：37℃反应5min；第二组：37℃反应15min；第三组：室温反应5min；第四组：室温反应15min，37℃反应15min条件下重复两次的od450nm值为2.413和2.049，同一批次内数值最高。p/n值分别为4.570和3.679，同一批次内比值最大。结果表明最佳底物反应时间是37℃反应15min(见表9)。表9底物反应时间结果table9substratereactiontimeresults综上，本实验建立的间接elisa检测方法最佳步骤为：(1)抗原包被用包被缓冲液将高压破碎的ss9抗原蛋白稀释至浓度为47μg/ml，加入到包被板中，每孔100μl，4℃包被过夜。(2)封闭用洗涤液洗涤反应板3次，每次3min，然后加入封闭液，每孔加200μl，37℃封闭120min。(3)加一抗甩掉封闭液，用洗涤液洗涤反应板3次，每次3min，用pbs将待检血清样品及标准阴阳性血清8倍稀释后加反应板，100μl每孔，于37℃作用60min。(4)加二抗(酶标抗体)甩掉一抗液，用洗涤液洗涤反应板3次，每次3min，每孔加100μl，加用0.9％的生理盐水稀释的辣根过氧化物酶标葡萄球菌a蛋白(ppa)，稀释浓度为1：1000，100μl每孔，37℃反应30min。(5)加底物显色甩掉二抗液，用洗涤液洗涤反应板3次，每次3min，在每孔中加入新配置的底物显色液100μl，最适条件下37℃避光反应15min。(6)终止反应用2mol/lh2so4每孔100μl终止反应。(7)结果判定在白色背景上，我们可以直接用肉眼观察结果，如果反应孔内颜色越深，则阳性程度越强，阴性反应则为无色或极浅(如图1)。在微孔板分光光度计上，于450nm处测od值。判定标准为od450nm值＞0.9053者判为阳性，od450nm值＜0.9053则为阴性。2.6特异性实验结果应用本实验建立的间接elisa检测方法分别检测口蹄疫、蓝耳、猪传染性胃肠炎、猪瘟阳性血清和ss9阳性血清，检验得出ss9阳性血清od450nm值基本在0.995～1.234之间，其他阳性血清检测值基本在0.068～0.617之间。根据本实验建立的阴阳性血清判定标准得到ss9阳性血清结果为阳性，其余结果均为阴性(见表10)。结果表明本次建立的间接elisa检测方法特异性良好。表10间接elisa特异性实验结果table10resultsofindirectelisaspecificexperiments2.7血清保质期实验结果将ss9阳性血清和阴性血清保存于﹣80℃中，分别于1天、7天、14天后取出按照间接elisa检测方法进行实验，每次检测3个阳性血清和3个阴性血清，其阳性血清od450值均＞0.9053，为阳性；阴性血清均＜0.9053，目前保存期试验仍在进行中(见表11)。表11血清保质期实验结果table11theexperimentalresultsofserumshelflife当前第1页12当前第1页12