本发明属于功能纳米材料的制备和应用技术领域，尤其是涉及一种谷胱甘肽模板法合成的金纳米团簇及其在抗氧化剂(例如抗坏血酸)检测中的应用。
背景技术：
近十几年来，抗氧化剂在医疗、保健、食品保鲜等领域内占有越来越重要的地位，引起人们的普遍关注。食品中广泛应用的合成抗氧化剂如丁基羟基甲苯、叔丁对甲氧酚制剂、特丁基对苯二酚等具有潜在毒性和致癌作用。目前，食品中添加的抗氧化剂最常见的是抗坏血酸。食品中的抗坏血酸在果蔬贮藏、食品加工中的变化关系到食品的品质和保存和人们的健康。因此，对食品中抗坏血酸的检测是十分重要的。抗坏血酸传统的检测方法主要有四种：滴定法、光度分析、高效液相色谱、电化学法。利用金纳米团簇来检测抗坏血酸是一种全新的方法。
金纳米团簇，就是纳米尺度的金原子团，也就是约几个到上千个乃至更多金原子的聚集体。制备金纳米团簇，常常会使用各种配体，例如dna，硫醇基，蛋白质，多聚体结合在纳米团簇的外层。不同的配体合成的金纳米团簇的化学和物理性质都不同。即使具有相似的原子核或相同大小的金原子，不同配体结合的金纳米团簇特性相差也很大。因此，根据配体的不同，金纳米团簇一般分为四种：巯基修饰的金纳米团簇、蛋白质型的金纳米团簇、dna型的金纳米团簇、聚合物型的金纳米团簇。
金纳米团簇具有的荧光性是由金团簇表面的等离子体振子的集体运动引起的，当在合适的外来光激发时，会产生受激的辐射，发生电子跃迁，发出荧光。金纳米团簇具有合成方法简便，超小的尺寸，良好的生物相容性，无毒等突出的优点，目前被研究人员应用于细胞转运、药物运输、酶活性调控及生物标记等众多领域。因此，利用金纳米团簇检测抗氧化剂这种全新的检测方法具有很好的应用和研究前景，需要进一步的研究和开发。
技术实现要素：
为了解决上述现有技术中的问题，本发明提供了以下技术方案。
本发明的一个方面提供一种谷胱甘肽金纳米团簇，其中所述谷胱甘肽金纳米团簇呈球形颗粒状，点阵平面间隔为0.215nm，au(111)面心立方晶格间距为0.21nm，平均直径在1.5-3.2nm之间。
进一步地，所述谷胱甘肽金纳米团簇在375nm处激发，发射光谱在500nm处开始上升，在565nm处荧光强度最高。
进一步地，所述谷胱甘肽金纳米团簇通过以下方法制备：将浓度为1-30mmol/l的氯金酸水溶液和浓度为5-150mmol/l的谷胱甘肽水溶液在5-50℃和搅拌条件下混合并反应，随后将反应液在60-90℃下保持15-30小时。
本发明的另一个方面提供一种检测抗氧化剂的方法，包括：
s000，提供根据本发明的所述谷胱甘肽金纳米团簇；
s200，测定经羟基自由基进行荧光淬灭的所述谷胱甘肽金纳米团簇的荧光强度；
s300，测定将待测样品加入经羟基自由基进行荧光淬灭的所述谷胱甘肽金纳米团簇后的荧光强度；
s400，在步骤s300中测定的荧光强度大于步骤s200中测定的荧光强度时，确定待测样品中含有抗氧化剂。
进一步地，所述检测抗氧化剂的方法还包括：s100，测定所述谷胱甘肽金纳米团簇的荧光强度，据此可确定s400中荧光强度的恢复程度，以便定量检测抗氧化剂的含量。
进一步地，所述抗氧化剂是抗坏血酸。
进一步地，步骤s100、s200和s300中的荧光强度在565nm波长处测定。
进一步地，所述荧光淬灭的时间为20-100分钟，优选40-100分钟，更优选80-100分钟。
进一步地，步骤s200和s300中所述羟基自由基由氯化亚铁水溶液和过氧化氢水溶液反应产生。
进一步地，步骤s200中，将所述谷胱甘肽金纳米团簇与氯化亚铁水溶液和过氧化氢水溶液混合反应后，测定其荧光强度。
进一步地，步骤s300中，将所述待测样品加入所述谷胱甘肽金纳米团簇与氯化亚铁水溶液和过氧化氢水溶液混合反应后，测定其荧光强度。
本发明的谷胱甘肽金纳米团簇会被氧化性强的羟基自由基氧化其结合的化学键，使其荧光淬灭。利用fe2++h2o2→fe3++·oh+oh-产生的羟基自由基使纳米金荧光淬灭，而抗坏血酸可以保护其荧光使其荧光恢复。不同浓度的抗坏血酸，荧光恢复程度也不同。根据荧光是否恢复定性检测抗氧化剂，根据荧光恢复程度定量检测抗氧化剂。金纳米团簇的荧光性对抗氧化剂的检测具有较好的灵敏性。
本发明针对食品抗氧化剂要快速且准确的检测，利用金纳米团簇的荧光特性，构建一套具有检测准确度高、快速、简单便捷的方法。
附图说明
图1是本发明谷胱甘肽金纳米团簇透射电子显微镜图，(a)透射电子显微图(b)高分辨透射电子显微图；
图2是本发明谷胱甘肽金纳米团簇的荧光光谱；
图3是本发明谷胱甘肽金纳米团簇与不同溶液混合的荧光光谱图；
图4是本发明谷胱甘肽纳米金团簇与不同浓度羟基自由基反应的荧光光谱图，(a)羟基自由基浓度1-1000μm；(b)羟基自由基浓度400μm和600μm；
图5是本发明谷胱甘肽纳米金团簇荧光强度与时间的关系曲线；
图6是本发明谷胱甘肽纳米金团簇的不同浓度抗坏血酸与荧光恢复程度的关系图，(a)抗坏血酸浓度200μm-800μm恢复的荧光强度；(b)抗坏血酸浓度200μm-800μm与荧光强度的关系图。
具体实施方式
在下面描述和图解本发明的示例性实施方案。为了清楚和准确，下面讨论的所述示例性实施方案可以包括优选的步骤、方法和特征，本领域普通技术人员将可以认识到，这些优选的步骤、方法和特征不是落在本发明范围内的必要条件。
在下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。在下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：谷胱甘肽金纳米团簇(gsh-au)溶液的合成和表征
1、谷胱甘肽金纳米团簇溶液的合成
在制备谷胱甘肽金纳米团簇之前，用王水浸泡所需要用的玻璃仪器，20分钟以上，然后用超纯水清洗3次，烘干待用。谷胱甘肽金纳米团簇是以还原型谷胱甘肽为模板和氯金酸反应生成。
分别取5ml浓度为20mmol/l氯金酸(购自华威锐科)水溶液和1.5ml浓度为100mmol/l还原型谷胱甘肽(购自广州市齐云生物技术有限公司)水溶液和43.5ml超纯水，在室温25℃下加入到装有转子的圆底烧瓶中，置于磁力搅拌器上，随后将反应后的溶液置于70℃的水浴中温浴24小时，然后在室温中冷却到可放入冰箱，制得的金纳米团簇溶液呈为黄色，在紫外灯光照射下会有红色荧光，将样品4℃避光保存备用。
2、谷胱甘肽金纳米团簇溶液的表征
选择透射电子显微镜，型号为feitecnaig20，在200kv的加速电压下，对谷胱甘肽金纳米团簇进行透射电镜和高分辨透射电镜的检测。
鉴别gsh-au是否制备成功，可以用波长为375nm的手提式紫外灯简单地检测是否有荧光，若要进一步进行表征，透射电子显微镜(tem)能够更具体地检测出纳米团簇的分布、尺寸和形貌。
由于电子的德布罗意波长非常短，透射电子显微镜的分辨率比光学显微镜高的很多，可以达到0.1-0.2nm，放大倍数为几万到百万倍。因此，使用透射电子显微镜可以用于观察样品的精细结构，可以看到在光学显微镜下无法看清的小于0.2μm的细微结构，如金纳米团簇。
将制备的谷胱甘肽金纳米团簇进行透射电子显微镜检测，tem结果如图1所示。由图1(a)可知，金纳米团簇具有较好的分散性，根据图1(b)可知道，显示点阵平面间隔为0.215nm，au(111)面心立方晶格间距(0.21nm)。制备的金纳米团簇的平均直径在1.5-3.2nm之间。因此，可以确定谷胱甘肽金纳米团簇在100个颗粒中的平均粒径为1.5-3.2nm。
根据tem图分析可知，所制备的谷胱甘肽金纳米团簇具有颗粒性小，团簇颗粒分散均匀呈球形，没有团聚的特点，且溶液稳定性较好。
选择日本日立f-7000荧光仪，检测谷胱甘肽金纳米团簇(gsh-au)荧光强度，发射光谱为450nm到725nm。如图2所示，谷胱甘肽金纳米团簇在375nm处激发，发射光谱在500nm处开始上升，在565nm处荧光强度最高，可以确认金纳米团簇的形成。随后的实验中，检测荧光强度都在375nm激发，在565nm发射。
实施例2：谷胱甘肽金纳米团簇荧光性对抗坏血酸(aa)的选择性实验
用日本日立f-7000荧光仪分别检测以下物质的荧光值：1)实施例1制备的gsh-au；2)将1ml实施例1制备的gsh-au与1ml浓度为100mol/l的过氧化氢溶液水溶液反应100分钟后的产物；3)将1ml实施例1制备的gsh-au与1ml浓度为100mol/l的氯化亚铁水溶液反应100分钟后的产物；4)将1ml实施例1制备的gsh-au与1ml浓度为100mol/l的过氧化氢溶液水溶液、1ml浓度为100mol/l的氯化亚铁水溶液和1ml浓度为100mol/l的抗坏血酸(aa)溶液反应100分钟后的产物；5)将1ml实施例1制备的gsh-au与1ml浓度为100mol/l的过氧化氢溶液水溶液和1ml浓度为100mol/l的氯化亚铁水溶液反应100分钟后的产物；6)纯水。结果如图3所示。
在图3中可以明显看到，各自将氯化亚铁和过氧化氢单独加入金纳米团簇溶液中对荧光几乎没有影响；将氯化亚铁和过氧化氢同时加入金纳米团簇溶液中，显示反应生成的·oh基本上完全淬灭了荧光；而加入抗坏血酸(aa)则在较大程度上对淬灭后的荧光进行了恢复。
实施例3：谷胱甘肽金纳米团簇对羟基自由基浓度的选择性实验
选取不同浓度值的等浓度氯化亚铁水溶液和过氧化氢水溶液各1ml，与1ml实施例1制备的谷胱甘肽金纳米团簇溶液反应，100分钟后上机检测荧光值变化，观察不同浓度溶液对荧光的淬灭程度。
谷胱甘肽金纳米团簇溶液在不同浓度的氯化亚铁和过氧化氢溶液的溶液中，呈现出不同程度的淬灭，如图4(a)，可以看出400μm为最接近完全淬灭的浓度值，600μm为已经完全淬灭的浓度。因此，选择400μm与600μm做进一步的对照实验。
浓度值分别为400μm和600μm的等浓度氯化亚铁水溶液和过氧化氢水溶液个1ml，分别加入1ml实施例1制备的谷胱甘肽金纳米团簇溶液中，反应60min后用荧光分光光度计进行荧光性检测。如图4(b)中，400μm与600μm浓度的过氧化氢溶液相比，只加入过氧化氢溶液时，荧光强度无明显的影响；400μm与600μm浓度的氯化亚铁溶液相比，前者对荧光强度影响相对较小，与未加之前的最高荧光强度相比降低得最少；同时600μm的羟基自由基浓度对于金纳米团簇为过淬灭浓度，所以选择400μm浓度的氯化亚铁溶液和过氧化氢溶液进行下一步实验。
实施例4：谷胱甘肽金纳米团簇荧光性恢复所需时间动力学实验
实施例1制备的谷胱甘肽金纳米团簇在4℃条件下保存，可以保持稳定的荧光特性。本发明利用金纳米团簇荧光可以被羟基自由基淬灭，抗坏血酸可以保护其荧光性使其恢复，从而根据荧光是否恢复进行定性分析，根据恢复程度进行定量分析。由于不同时间检测荧光强度不同，且在一定范围内反应时间越长，荧光强度恢复得越多，因此要做时间动力学实验来确定反应最适时间。
取1ml实施例1制备的谷胱甘肽金纳米团簇溶液与400μm浓度的氯化亚铁溶液和过氧化氢溶液各1ml以及1.2μm的抗坏血酸溶液1ml混合反应，随后立即使用荧光分光光度计检测其在565nm波长下的荧光值，1分钟检测1次，一共检测90次。结果如图5所示。横坐标为反应时间，纵坐标是该反应时间对应的荧光强度。在0到20分钟，体系荧光强度上升的较快，随后到100分钟上升比较缓慢，在99分钟后荧光强度趋于稳定。因此，将纳米金溶液与抗坏血酸溶液反应适合时间确定为100分钟。
实施例5：谷胱甘肽金纳米团簇荧光性检测不同浓度抗坏血酸实验
分别吸取一系列梯度的抗坏血酸溶液1ml，然后与400μm浓度的氯化亚铁溶液和过氧化氢溶液各1ml以及实施例1制备的谷胱甘肽金纳米团簇1ml反应100分钟后，进行荧光检测。结果示于图6，其中(a)示出了抗坏血酸浓度200μm-800μm恢复的荧光强度；(b)给出了抗坏血酸浓度200μm-800μm与荧光强度的关系图。
可以看到，反应后的荧光强度恢复程度随着抗氧化剂aa浓度的增加而增加，荧光值在565nm处存在最大值，本文使用的金纳米团簇(auncs)是用谷胱甘肽与氯金酸还原反应制得的，强氧化基团羟基自由基会氧化使gsh-au的荧光淬灭，而抗坏血酸可以与羟基自由基反应从而使荧光恢复。
本发明采用了简单便捷的方法合成谷胱甘肽金纳米团簇，以谷胱甘肽为模板与氯金酸在70℃下水浴24小时反应生成金纳米团簇。制备的金纳米团簇溶液粒径小，稳定性好且具有较好的荧光性，从而根据荧光是否恢复对抗坏血酸定性分析，根据恢复程度定量分析。该检测方法具有简单便捷，灵敏度高，选择性好等特点。
在本发明实验中，利用谷胱甘肽为模板合成的金纳米团簇，溶液粒径小，稳定性好，且具有较强的荧光性。荧光在375nm处激发，在565nm处发射。当羟基自由基浓度在200μm到1000μm时，反应后荧光淬灭程度随浓度增加而增强。当抗坏血酸浓度在200μm到800μm浓度的抗坏血酸，抗坏血酸浓度越高荧光恢复程度越高。可以根据实验数据做出的浓度与荧光恢复的关系来对抗坏血酸定量检测。
本发明针对食品抗氧化剂要快速且准确的检测，利用金纳米团簇的荧光特性，构建一套具有检测准确度高、快速、简单便捷的方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。