蛋白酶检测用电化学传感器及制备方法及检测方法与流程

本发明涉及一种用于蛋白酶检测的电化学传感器及制备方法及检测方法，属于化学检测技术领域。

背景技术：

蛋白酶能够水解蛋白质或多肽中的肽键。它在消化吸收、创口愈合、功能免疫等方面具有决定性作用。一些重大疾病的发生与蛋白酶的含量和活性变化密切相关，例如，癌症、细胞凋亡、阿尔茨海默病、艾滋病等等。因此，蛋白酶检测在这些重大疾病的诊断和治疗研究等方面具有重要意义。目前用于检测蛋白酶的方法主要有高效液相色谱、凝胶色谱、质谱和荧光光谱等，但高效液相色谱、凝胶色谱、质谱需要特殊的仪器、灵敏度较低、分析成本较高。荧光光谱法往往需要对酶基底（通常是多肽）两端进行标记、耗时耗力，此外，多肽两端被标记后有可能会影响蛋白酶催化切割的效率。介于蛋白切割反应在研究生命活动及疾病防治中的重大作用，建立一种低成本、简单快速、适于在一般实验室或临床中监控蛋白酶含量或活性变化的方法是当前研究的热点之一。

电化学传感技术是根据电化学原理，将待测物质的浓度变化转化为电信号变化的一种传感技术。该技术的突出特点在于研究信息在表面上的^“聚焦^”与增强、样品的需要量极微、分离纯化简便、灵敏度高、选择性好等。目前用于蛋白酶检测的电化学传感器的主要设计理念是：将基底多肽的一端修饰上能够产生电化学信号的基团（如二茂铁、亚甲基蓝、酶标记物等），用于产生电信号，另一端修饰上特殊的氨基酸（通常是半胱氨酸），用于将多肽固定到电极表面（通常是金电极）。当多肽被蛋白酶切割之后，电信号基团就会从电极表面脱落，导致电流降低。但是，这类电化学传感方法在实际应用中存在的主要问题是：一是电信号基团自身容易降解或变质，不利于电极芯片的长时间保存；二是这种“信号衰减”的检测模式具有较大的背景电流，灵敏度较低、误差较大。因此，开发一种简单灵敏、“信号增强”的高通量电化学传感方法，对于蛋白酶的检测和一些重大疾病的监控具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服目前的蛋白酶检测中存在的上述问题，提供一种蛋白酶检测用电化学传感器及制备方法及检测方法。

为实现本发明的目的，采用了下述的技术方案：蛋白酶检测用电化学传感器，所述的电化学传感器采用在玻碳电极表面修饰一层芘丁标记的多肽-石墨烯复合物，所述的多肽的序列特征是：所述的多肽能够被对应的蛋白酶切割，切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸，第四个氨基酸是侧链上修饰了芘丁基团的赖氨酸。

蛋白酶检测用电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

a：多肽-石墨烯复合物的制备：将石墨烯纳米片与芘丁标记的多肽溶液超声混合30分钟，所述的多肽的序列特征是：所述的多肽能够被对应的蛋白酶切割，且切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸，第四个氨基酸是侧链上修饰了芘丁基团的赖氨酸，离心弃除上层剩余的多肽，然后用磷酸缓冲溶液将所得到的多肽-石墨烯复合物离心洗涤3次，于4℃下保存备用；

b：电化学传感器的制备：将步骤a中制备得到的芘丁标记的多肽-石墨烯复合物多用磷酸缓冲溶液震荡分散，取出5微升混合液滴加到直径为3mm的玻碳电极表面，自然晾干，得到电化学传感器。

蛋白酶检测的检测方法，包括以下步骤：

1：电化学传感器的制备，包括以下子步骤：

1.1：多肽-石墨烯复合物的制备：将石墨烯纳米片与芘丁标记的多肽溶液超声混合30分钟，所述的多肽的序列特征是：所述的多肽能够被对应的蛋白酶切割，且切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸，第四个氨基酸是侧链上修饰了芘丁基团的赖氨酸，离心弃除上层剩余的多肽，然后用磷酸缓冲溶液将所得到的多肽-石墨烯复合物离心洗涤3次，于4℃下保存备用；

1.2：电化学传感器的制备：将步骤a中制备得到的芘丁标记的多肽-石墨烯复合物多用磷酸缓冲溶液震荡分散，取出5微升混合液滴加到直径为3mm的玻碳电极表面，自然晾干，得到电化学传感器；

2：蛋白酶的检测：

将步骤1得到的电极浸泡于待检测的蛋白酶溶液中，取出后用二次水冲洗干净，再在包含50μm硫酸铜的磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描测试，所述的磷酸缓冲溶液浓度为0.2m，ph值为7.4；

进一步的，循环伏安扫描采用三电极体系，步骤1得到的电化学传感器为工作电极，饱和的ag/agcl电极为参比电极，pt电极为辅助电极。

本技术发明的优点与效果为：(1)传感电极的制备过程简单、成本较低；(2)不需要对蛋白酶基底预先进行电信号标记，直接通过电催化水分子的氧化即可产生电信号，具有误差小、环境友好等优点；(3)酶切割后的多肽片段能够与铜离子络合，形成可以催化水氧化的电催化剂，具有灵敏度高、环境友好等优点；（4）本方法属于“信号增强”的高通量电化学传感方法，随着蛋白酶浓度的增加，电信号逐渐增强，具有背景电流低、抗干扰能力强等优点，该技术的研制成功可实现多种类型蛋白酶的电化学检测。

附图说明

图1是传感器在经过和不经过caspase-3溶液浸泡时的循环伏安图。

图2是对caspase-3检测的线性曲线。

图3是对caspase-3检测的选择性。

图4是对胰蛋白酶检测的线性曲线。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明的实施实例。这些实施实例仅仅是对该工艺的阐述，不限制本发明的范围，本发明中用以下实施例说明，但不限于下述实施例，任何变化实施都包含在本发明的技术范围内。

本发明中所使用的多肽的序列特征是：所述的多肽能够被对应的蛋白酶切割，且切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸，第四个氨基酸是侧链上修饰了芘丁基团的赖氨酸，对应的蛋白酶即所要检测的蛋白酶。图1中，曲线a是多肽（ac-gdevdsghk-芘丁）-石墨烯复合物修饰的电极没有在caspase-3溶液中浸泡时得到的循环伏曲线，曲线b是该修饰电极在caspase-3溶液中浸泡一定时间后，再在包含铜离子的磷酸缓冲溶液中扫描的循环伏安曲线，caspase-3的浓度是50ng/ml。图2是在0.8v处的氧化电流值与caspase-3浓度的线性曲线，caspase-3的浓度依次是0.05,0.5,5,10,20ng/ml。图3是传感器的选择性。从1到7依次对应的是：空白对照实验，20ng/mlcaspase-3，20ng/ml牛血清蛋白，20ng/ml凝血酶，20ng/ml胰蛋白酶，20ng/mlβ-分泌酶，10%的血清。图4是多肽（ac-gkgghk-芘丁）-石墨烯复合物修饰电极对胰蛋白酶检测的线性曲线。多肽（ac-gdevdsghk-芘丁）及多肽ac-gkgghk-芘丁为上海强耀生物科技公司生产。

实施例1：

1：电化学传感器的制备：

1.1：多肽-石墨烯复合物的制备：向0.5mg石墨烯纳米片中加入1ml包含0.1mm多肽（ac-gdevdsghk-芘丁）的磷酸缓冲溶液（10mm，ph7.4），超声混合30分钟，离心弃除上层剩余的多肽，然后用磷酸缓冲溶液将所得到的多肽-石墨烯复合物离心洗涤3次，于4℃下保存备用；

1.2电化学传感器的制备：将步骤1.1中制备得到的多肽-石墨烯复合物用磷酸缓冲溶液震荡分散，取出5微升混合液，滴加到直径为3mm的玻碳电极表面，于室温下自然晾干，得到多肽（ac-gdevdsghk-芘丁）-石墨烯复合物修饰的电极，即本发明的电化学传感器；

2：caspase-3的检测

将1中得到的多肽（ac-gdevdsghk-芘丁）-石墨烯复合物修饰的电极分别在包含不同浓度caspase-3的磷酸缓冲溶液中浸泡20分钟，用二次水轻轻冲洗电极表面，再将电极浸泡于包含50μm硫酸铜的磷酸缓冲溶液（0.2m，ph7.4）中进行循环伏安扫描，扫描速度为50mv/s，扫描范围是0.3~1.0v。从图1可以看出，多肽（ac-gdevdsghk-芘丁）-石墨烯复合物修饰的电极在电解质溶液中没有氧化还原峰（曲线a），表明该修饰电极不能催化水分子的氧化，但是，当该电极在caspase-3溶液中浸泡一定时间后，出现了一个明显的氧化峰（曲线b），表明石墨烯表面的多肽被切割后，残留在电极表面的多肽片段（sghk-芘丁）能够与铜离子形成络合物，从而催化水分子的电氧化。图2是氧化电流值与caspase-3浓度之间的线性关系，从图中可以看出，电流值随着caspase-3浓度的增加而增加。因此，该修饰电极可以用于caspase-3的检测，检测限为0.01ng/ml，线性范围为0.05~20ng/ml。

实施例2：对caspase-3检测的选择性：

将实施例:1中的caspase-3换成待测试的物质，其它步骤的条件不改变，制备得到各工作电极进行测试。实验结果如图3所示，1到7依次对应的是：空白对照实验，20ng/mlcaspase-3，20ng/ml牛血清蛋白，20ng/ml凝血酶，20ng/ml胰蛋白酶，20ng/mlβ-分泌酶，10%的血清。从图中可以看出，采用3~7蛋白质产生的电信号和空白对照的电信号基本一样，说明本发明的方法可以选择性检测caspase-3。

实施例3：胰蛋白酶的检测

将实施例1中多肽（ac-gdevdsghk-芘丁）更换为多肽(ac-gkgghk-芘丁)，得到多肽(ac-gkgghk-芘丁)-石墨烯修饰的电极，然后分别在包含不同浓度胰蛋白酶的磷酸缓冲溶液中浸泡20分钟。其它步骤和实验条件与实施例1中caspase-3的检测一致。图4是电流值与胰蛋白酶浓度的线性关系。从图中可以看出，电流值随着胰蛋白酶浓度的增加而增大，线性范围是1~500ng/ml，检测限为0.5ng/ml。当采用实施例3中的caspase-3，牛血清蛋白，凝血酶，β-分泌酶，10%的血清做对照实验时，所得的电信号和空白对照实验的电流值基本一样，说明该修饰电极对胰蛋白酶的检测具有很好的选择性。因此，如果将石墨烯表面的多肽换成对某一蛋白酶特异响应的多肽片段，该方法可以用于相应蛋白酶的电化学检测。

序列表

<110>安阳师范学院

<120>蛋白酶检测用电化学传感器及制备方法及检测方法

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<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

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