一种快速筛选红三叶异黄酮定量检测中所用标准品的方法与流程

本发明属于药物和食品质检领域，具体涉及一种快速降低筛选红三叶异黄酮定量检测中所用标准品的方法。

背景技术：

红三叶(Trifolium pratense L.)，又名红车轴草、红花苜蓿等，是一种分布范围广泛的优良豆科牧草。因红三叶中含有高含量的异黄酮类化合物，是国际上公认的治疗妇女更年期综合征疗效较为确切的一种植物药，其销量在美国多年来一直名列植物药的前10位。此外，有研究表明，红三叶异黄酮过量也会导致进食的家畜激素紊乱。

红三叶总异黄酮含量主要是通过紫外分光光度法进行。一般选用1-2个标准品用于表征红三叶中异黄酮总含量，速度快，测试成本低，特别适合大量样品测定、半定量或不同样品间的比较分析，用于异黄酮的开发和应用研究中。随着研究的深入和产业的升级，对异黄酮含量测定精确度的要求也越来越高。影响其测定精度的主要因素有测定波长、吸光度范围和溶剂的选择以及恰当的标准品。而在这些因素中最重要的就是标准品的选择，因为标准品的选择同时会影响其它因素。一般认为，选用含量较高的异黄酮成分将会减小测定中的系统误差。

红三叶异黄酮的主要有芒柄花素(Formononetin)、鹰嘴豆素A(Biochanin A)、染料木素(Genistein)和大豆苷元(Daidzein)4种异黄酮成分。目前，利用紫外分光光度法对红三叶中异黄酮的含量进行标定和检测中多采用1种异黄酮为标准品，且以鹰嘴豆芽素A和芒柄花素居多，也有报道用大豆苷元，或染料木素作为标准品。有少数研究采用2种标准品进行标定，例如用芒柄花素和鹰嘴豆素A组合，用大豆苷元和染料木素组合作为标准品。

然而关于如何选择标准品及其所带来误差的相关研究未见报道，这将影响着红三叶产业的进一步发展。本专利将提供一种科学快速筛选标准品的方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种快速筛选红三叶异黄酮定量检测中所用标准品的方法。利用2-4种红三叶异黄酮标准品，快速筛选适合用于紫外分光光度法测定红三叶异黄酮含量的标准品。

快速筛选用于红三叶异黄酮含量测定标准品的方法，其关键步骤如下：利用毛细管，分别将四个标准品芒柄花素(Formononetin)、鹰嘴豆素A(Biochanin A)、染料木素(Genistein)和大豆苷元(Daidzein)的混合样,或鹰嘴豆素A和芒柄花素的混合样品，和红三叶样品待测液依次均匀点在已制备好的GF254硅胶薄层层析板，以氯仿：甲醇(30：1—2：1)或石油醚：丙酮(20：1-1：2)进行展开。待展开液到达薄层板上沿1-2mm处时，取出层析板，晾干，在254nm紫外灯下观察。

其中如果样品色素较重，优选氯仿：甲醇作为展开剂。

如果薄层色谱板上，标准品芒柄花素或大豆苷元的斑点较为明显，建议样品异黄酮含量检测以芒柄花素或大豆苷元为标准品；如果鹰嘴豆素A或染料木素的斑点较为明显，应以鹰嘴豆素A或染料木素为标准品。

本发明的结果经高效液相色谱法验证，科学合理，工艺简单，筛选速度快，检测成本低，不仅可用于科研工作，而且适用于多种检测环境，容易在生产实践中大规模采用。

附图说明

图1为红三叶提取物与4种异黄酮成分的UV吸收图；

图2为标准品和样品的薄层层析结果；

图3为4个标准品混合样的HPLC色谱图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1不同标准品对分光光度法测定红三叶异黄酮结果的影响

1、红三叶样品的制备：随机采集的三个红三叶样品，自然风干，粉碎，命名为样品1、2和4。取自然风干的红三叶叶片0.2g，用8mL甲醇浸泡，超声波提取30分钟。离心10分钟后，取上清液，通过0.45微米有机膜过滤，制备待测液。

2、标准品的制备：

称取5mg芒柄花素对照品置于100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得到浓度为0.05mg/mL的芒柄花素对照品溶液。

称取染料木素标准品10mg于100mL容量瓶中，然后加甲醇标定到刻度，即得到浓度为0.1mg/mL的染料木素标准液。

称取5mg鹰嘴豆素A对照品置于100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得到浓度为0.05mg/mL的鹰嘴豆素A对照品溶液。

称取大豆苷元标准品10mg于100mL容量瓶中，然后加甲醇标定到刻度，即得到浓度为0.1mg/mL的大豆苷元标准液。

分别准确吸取各化合物标准液，稀释成一系列浓度，在紫外分光光度计上260nm处进行测定吸收值，制作各个标准品的标准曲线依次如下：

3、对红三叶待测液的测定

将制备好的红三叶待测液依次在紫外分光光度计上260nm处进行测定吸收值，依次各个标准品的标准曲线进行标定，结果见表1。每个样品重复测定6次。

表1不同标准品所标定的红三叶异黄酮含量

注：表中B代表以鹰嘴豆素A标准曲线进行标定所计算得到的异黄酮含量；G代表以染料木素标准曲线进行标定所计算得到的异黄酮含量；F代表以芒柄花素标准曲线进行标定所计算得到的异黄酮含量；D代表以大豆苷元标准曲线进行标定所计算得到的异黄酮含量。

从表1中，可以看出4种标准品所标定的异黄酮含量具有明显系统差异，其中鹰嘴豆素A与染料木素的结果接近，芒柄花素和大豆苷元的结果相近。这可能是由于其化合物的结构和紫外吸收规律接近所致，见图1。因此在实践操作中选用芒柄花素和大豆苷元，与鹰嘴豆素A和染料木素分别作为两组标准品，两组标准品内部误差较小，但组间所标定的含量差异较大。选用含量较高的成分，得到的异黄酮含量结果将更为准确。

实施例2薄层色谱法筛选标准品方法

利用毛细管，分别将四个标准品的混合样和红三叶1、2和4样品待测液点在已制备好的硅胶GF254薄层层析板，放入展开瓶中，以氯仿：甲醇＝15：1为展开剂进行展开。待展开剂到达薄层板上沿1-2mm处时，取出层析板，晾干，在254nm紫外灯下观察。

如图2所示，图中B代表鹰嘴豆素A；F代表芒柄花素；G代表染料木素；D代表大豆苷元。样品1和2芒柄花素(标品F)的斑点较为明显，而样品4鹰嘴豆素A(标品B)的斑点较为明显。

由该结果，建议样品1和2以芒柄花素或大豆苷元为标准品，样品4应以鹰嘴豆素A或染料木素。

实施例3薄层色谱法筛选标准品方法

因为标准品鹰嘴豆素A和芒柄花素的紫外吸收较强，可以只利用这两种标准品完成筛选。

利用毛细管，分别将混有标准品鹰嘴豆素A和芒柄花素的混合样和红三叶1、2和4样品待测液点在已制备好的硅胶GF254薄层层析板，以氯仿：甲醇＝20：1进行展开。待展开剂到达薄层板上沿1-2mm处时，取出层析板，晾干，在254nm紫外灯下观察。

如图2所示，样品1和2中芒柄花素(标品F)的斑点较为明显，而样品4中鹰嘴豆素A(标品B)的斑点较为明显。

由该结果，建议样品1和2以芒柄花素或大豆苷元为标准品，样品4应选用鹰嘴豆素A或染料木素。

实施例4薄层色谱法筛选标准品方法

利用毛细管，分别将四个标准品的混合样和红三叶1、2和4样品待测液点在已制备好的硅胶GF254薄层层析板，以石油醚：丙酮＝3：1进行展开。待展开剂到达薄层板上沿1-2mm处时，取出层析板，晾干，在254nm紫外灯下观察。

结果表明，样品1和2中芒柄花素(标品F)的斑点较为明显，而样品4中鹰嘴豆素A(标品B)的斑点较为明显。

由该结果，建议样品1和2以芒柄花素或大豆苷元为标准品，样品4应选用鹰嘴豆素A或染料木素。

此外，与实施例2相比较，样品中的植物色素对本筛选方法干扰较大，实施例3的方法适合样品色素较轻，例如根、茎样品等。

实施例5高效液相色谱法对本方法结果的验证

利用高效液相色谱(HPLC)对上述红三叶样品同时进行检测，并对样品中4个标准品的含量分别进行定量。

HPLC色谱条件为：

流动相A为0.2％醋酸水，流动相B为色谱纯甲醇。

0-5min 40％B；10-20min 70％B；35min 85％B；40min 100％B。

将实施例1中制得的标准品溶液依次稀释成5个不同浓度的标准品溶液，通过上述HPLC色谱条件检测，建立4种标准品的HPLC标准曲线。分别为：

如图3所示，其中，四个标准品的出峰顺序依次是大豆苷元，染料木素，芒柄花素，鹰嘴豆素A。液相检测结果表明，不同样品之间异黄酮的含量组成均有较大差异(表2)。样品1和2中大豆苷元的含量较高，建议以大豆苷元为标准品进行紫外分光光度法的检测，根据化学结构和吸收相似规律，也可以用芒柄花素代替作为标准品。样品4染料木素的含量最高，应选用染料木素作为标准品，也可以用鹰嘴豆素A作替代。对红三叶样品1、2和4进行HPLC色谱检测结论，与薄层色谱法(实施例2-4)一致。

表2红三叶样品的不同异黄酮成分含量

高效液相色谱法的验证结果，充分说明本专利所建立的薄层色谱筛选标准品的方法科学合理，省时省力，检测费用低，而且也容易在实验室外实现，对测定环境要求低。

本发明工艺简单，技术成熟可靠，开发成本低，易于实现，对检测环境要求低，具有良好的开发应用前景。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。