一种糖尿病检测标志物的检测试剂盒的制作方法

本实用新型属于医疗器械领域，涉及一种糖尿病检测标志物的检测试剂盒。

背景技术：

糖尿病是一组代谢疾病，其最基本的特点是由于胰岛素分泌不足或和胰岛素作用缺陷导致的高血糖症，常常会伴随着高血压和脂质代谢紊乱，其中二型糖尿病占总患病人数的90％-95％。据美国疾病预防控制中心(CDC)最新数据显示，美国现在大概有2910万糖尿病患者，占总人口的9.3％，并且有8900万人具有患糖尿病患者的风险，按照目前的发展速度，在2025到2050期间，每5个美国人中就会有一个是糖尿病患者。中国目前已有1亿糖尿病患者，并且，由于很多偏远地区医疗情况落后，国内仍有大量糖尿病潜在患者未被统计。虽然糖尿病本生并不是致死疾病，但是糖尿病往往会伴随多种并发症，如糖尿病足，糖尿病视网膜病变，肾毒性等严重影响患者的生活质量，另外，糖尿病诱发的心血管疾病已逐渐成为主要的致死疾病之一。

HbA1c作为反映平均血糖和评价血糖控制的金标准已被广泛应用。2010年美国糖尿病学会(ADA)已把HbA1c≥6.5％作为糖尿病的首要诊断标准，最近WHO也建议在条件成熟的地区采用HbA1c作为诊断糖尿病的工具，并建议HbA1c≥6.5％作为诊断糖尿病的切点。然而我国HbA1c诊断糖尿病切点的相关资料相对不足，尤其是我国HbA1c测定的标准化程度不够，这包括测定仪器和测定方法的质量控制存在着明显的地区差异。因此，在我国应用HbA1c诊断糖尿病为时尚早，否则可能会导致糖尿病诊断上的混乱，中华医学会糖尿病学分会也不推荐此法。

胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)是IGFBP超家族的一员，共有234个氨基酸。其与配体IGF有高度亲和性，能够调节IGF与IGF-R的结合，进行IGF信号通路的调节。CN 202471724 U公开了一种检测胰岛素样生长因子结合蛋白-1的试剂盒，该试剂盒的标志物用于胎膜早破的辅助诊断，从而预测分娩。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种糖尿病检测标志物的检测试剂盒，该试剂盒标志物特异性强，该试剂盒检测方法简便快捷，利于临床检测，可进行高通量、低成本的酶联检测仪检测。

为达到此实用新型目的，本实用新型采用以下技术方案：

一方面，本实用新型提供一种糖尿病检测标志物的检测试剂盒，其包括盒体、可开启的盒盖、储存单元和位于盒体内部的凹槽，所述储存单元位于凹槽内，所述储存单元包括胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)抗体液储存单元、酶标液储存单元、校准品储存单元、底物液储存单元、终止液储存单元、样本稀释液储存单元和洗涤液储存单元。

根据本实用新型，所述IGFBP-1抗体液储存单元包括至少一个IGFBP-1抗体储存瓶1，所述IGFBP-1抗体储存瓶1含有羊抗人IGFBP-1抗体。

根据本实用新型，所述酶标液储存单元包括至少一个酶标液储存瓶2，所述酶标液储存瓶2含有生物素标记的辣根过氧化物酶。

根据本实用新型，所述校准品储存单元包括至少一个校准品储存瓶3，所述校准品储存瓶3含有重组人胰岛素样生长因子结合蛋白-1。

根据本实用新型，所述底物液储存单元包括底物A储存瓶4和底物B储存瓶5。

根据本实用新型，所述底物A储存瓶4中含有3’3’5’5’-四甲基联苯胺，所述底物B储存瓶5中含有过氧化脲。

根据本实用新型，所述终止液储存单元包括至少一个终止液储存瓶6，所述终止液为浓度为硫酸。

根据本实用新型，所述样本稀释液储存单元包括至少一个样本稀释液储存瓶7，所述样本稀释液储存瓶7含有BSA基质液。

优选地，所述洗涤液储存单元包括至少一个洗涤液储存瓶8，所述洗涤液储存瓶8含有Tween 20的PBS基质液。

根据本实用新型，所述试剂盒还包括质控品。

优选地，所述质控品为质控人血浆。

优选地，所述质控品包括高值质控品和低值质控品。

优选地，所述高值质控品为浓度为5ng/mL的质控人血浆。

优选地，所述低值质控品为浓度为0.5ng/mL的质控人血浆。

本实用新型中，所述高值质控品、低值质控品均为临床人血浆，经鉴定HBV、HCV、HIV1、HIV2、TP均为阴性。

根据本实用新型，所述检测试剂盒还包括酶标板、封板膜和说明书。

本实用新型中，所述试剂盒的具体使用方法如下：

1、提取血液中的样本

静脉穿刺法采集静脉血，血样采集管宜采用国标肝素钠真空采血管，血样经过滤或离心方式处理为血浆后用于检测，避免使用溶血、黄疸和脂血样本；

样本保存：24小时内用于测定时，样本可在2-8℃下暂存待测，否则，样本必须保存在-20℃或更低温度下，长期保存的样本应避免反复冻融。

2、实验前准备

(1)复温：待测样本和试剂盒在使用之前应恢复温度至室温(22～26℃)。

(2)样本稀释：所有样本在测定前，需采用样本稀释液进行3倍稀释。

(3)酶结合液：IGFBP-1抗体液与酶标液按1：1的体积比混合，涡旋至少10秒备用。混合后的酶结合液在1天内有效。

(4)显色液：底物A与底物B按1：10的体积比混合，涡旋至少10秒备用，混合后的显色液在2小时内有效。

3、检测

(1)拆封酶标板的铝箔包装，取出本次实验所需的板条。剩余部分应及时封存，避免受潮；

(2)采用单通道移液器(建议最大量程为100μl)在酶标板孔内按顺序进行加样，每孔加样量为100μl；

提示：加样时吸头可轻贴微孔下壁，以避免吸头挂液，整个加样过程要求不超过15分钟；

(3)裁剪适当大小的封板膜封板，平放置96微孔板振荡器上，调节转速在200～250转/分钟，室温下孵育60分钟；

(4)弃液，采用多通道移液器(建议最大量程为300μl)每孔中加入250～300μl洗涤液，静置1分钟；

(5)重复上步骤4一次，弃液，在干净的吸水纸上拍干板孔内的余液；

(6)每孔加入100μl酶结合液，封板膜封板，平放置振荡器上，200～250转/分钟，室温下孵育60分钟；

(7)弃液，在干净的吸水纸上拍干板孔内余液。每孔中加入250～300μl洗涤液，静置1分钟；

(8)重复上步骤7四次，即共洗板5次；

提示：每次弃液后，需在干净的吸水纸上拍干板孔内的余液；

(9)每孔加入100μl显色液(避免强光照射)，平放置振荡器上，200～250转/分钟，室温下孵育15分钟；

提示：视梯度校准品显色情况，可适当延长或缩短显色反应时间；

(10)每孔加入100μl终止液，终止显色；

(11)在10分钟内采用酶标仪在光吸收模式下以450nm、630nm双波长测定光吸收(OD)值，设定空白对照；

(12)采用公式：OD＝OD450nm-OD630nm计算输出各微孔测定OD值。

相对于现有技术，本实用新型具有以下有益效果：

(1)本试剂盒结构简单、设计合理、使用方便、检测过程所用的试剂均单独分管包装，避免了试剂间的相互污染；

(2)本试剂盒评价标准为IGFBP-1的浓度在2327.6-2695.8pg/ml为正常范围，与传统的检测血糖或是脂类的试剂盒相比，更加稳定，受外界影响小，可以真实的反应患者的糖尿病状况。

附图说明

图1是糖尿病检测标志物的检测试剂盒示意图，其中，图中分别为：1-胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体储存瓶，2-酶标液储存瓶，3-校准品储存瓶，4-底物A储存瓶，5-底物B储存瓶，6-终止液储存瓶，7-样本稀释液储存瓶，8-洗涤液储存瓶；

图2为本试剂盒校准品稀释的示意图；

图3为IGFBP-1ELISA检测的标准曲线；

图4为手术治疗前后IGFBP-1的浓度差异比较。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本实用新型的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本实用新型，不应视为对本实用新型的具体限制。

实施例1试剂盒的组装

如图1所示，本实用新型提供一种糖尿病检测标志物的检测试剂盒，其包括盒体、可开启的盒盖、储存单元和位于盒体内部的凹槽，所述储存单元位于凹槽内，所述IGFBP-1抗体液储存单元、酶标液储存单元、校准品储存单元、底物液储存单元、终止液储存单元、样本稀释液储存单元和洗涤液储存单元；

所述IGFBP-1抗体液储存单元包括至少一个IGFBP-1抗体储存瓶1，所述IGFBP-1抗体储存瓶1含有羊抗人IGFBP-1抗体；

所述酶标液储存单元包括至少一个酶标液储存瓶2，所述酶标液储存瓶2含有生物素标记的辣根过氧化物酶；

所述校准品储存单元包括至少一个校准品储存瓶3，所述校准品储存瓶3含有重组人胰岛素样生长因子结合蛋白-1；

所述底物液储存单元包括底物A储存瓶4和底物B储存瓶5，所述底物A储存瓶4中含有3’3’5’5’-四甲基联苯胺，所述底物B储存瓶5中含有过氧化脲；

所述终止液储存单元包括至少一个终止液储存瓶6，所述终止液为浓度为硫酸；

所述样本稀释液储存单元包括至少一个样本稀释液储存瓶7，所述样本稀释液储存瓶7含有BSA基质液；

所述洗涤液储存单元包括至少一个洗涤液储存瓶8，所述洗涤液储存瓶8含有Tween 20的PBS基质液；

所述检测试剂盒还包括酶标板、封板膜和说明书。

本实施例中的试剂盒是实验室自用试剂盒，无需质控品检验。

实施例2试剂盒的组装

本实用新型提供一种糖尿病检测标志物的检测试剂盒，其包括盒体、可开启的盒盖、储存单元和位于盒体内部的凹槽，所述储存单元位于凹槽内，所述IGFBP-1抗体液储存单元、酶标液储存单元、校准品储存单元、底物液储存单元、终止液储存单元、样本稀释液储存单元和洗涤液储存单元；

所述IGFBP-1抗体液储存单元包括至少一个IGFBP-1抗体储存瓶1，所述IGFBP-1抗体储存瓶1含有羊抗人IGFBP-1抗体；

所述酶标液储存单元包括至少一个酶标液储存瓶2，所述酶标液储存瓶2含有生物素标记的辣根过氧化物酶；

所述校准品储存单元包括至少一个校准品储存瓶3，所述校准品储存瓶3含有重组人胰岛素样生长因子结合蛋白-1；

所述底物液储存单元包括底物A储存瓶4和底物B储存瓶5，所述底物A储存瓶4中含有3’3’5’5’-四甲基联苯胺，所述底物B储存瓶5中含有过氧化脲；

所述终止液储存单元包括至少一个终止液储存瓶6，所述终止液为浓度为硫酸；

所述样本稀释液储存单元包括至少一个样本稀释液储存瓶7，所述样本稀释液储存瓶7含有BSA基质液；

所述洗涤液储存单元包括至少一个洗涤液储存瓶8，所述洗涤液储存瓶8含有Tween 20的PBS基质液；

所述试剂盒还包括质控品，所述质控品包括高值质控品和低值质控品，所述高值质控品为浓度为5ng/mL的质控人血浆，所述低值质控品为浓度为0.5ng/mL的质控人血浆；

所述检测试剂盒还包括酶标板、封板膜和说明书。

该实施例中的试剂盒为市面流通的检测试剂盒，需要通过质控品来检验检测的效果，后续试验采用该实施例中的试剂盒。

实施例3试剂盒的标准曲线的制备

1、实验前准备

(1)复温：待测样本和试剂盒在使用之前应恢复温度至室温(22～26℃)。

(2)样本稀释：将校准品在测定前，需采用样本稀释液进行3倍稀释，稀释操作如图2所示。

(3)酶结合液：IGFBP-1抗体液与酶标液按1：1的体积比混合，涡旋至少10秒备用。混合后的酶结合液在1天内有效。

(4)显色液：底物A与底物B按1：10的体积比混合，涡旋至少10秒备用，混合后的显色液在2小时内有效。

3、检测

(1)拆封酶标板的铝箔包装，取出本次实验所需的板条。剩余部分应及时封存，避免受潮；

(2)采用单通道移液器(建议最大量程为100μl)在酶标板孔内按顺序进行加样，每孔加样量为100μl；

提示：加样时吸头可轻贴微孔下壁，以避免吸头挂液，整个加样过程要求不超过15分钟；

(3)裁剪适当大小的封板膜封板，平放置96微孔板振荡器上，调节转速在200～250转/分钟，室温下孵育60分钟；

(4)弃液，采用多通道移液器(建议最大量程为300μl)每孔中加入250～300μl洗涤液，静置1分钟；

(5)重复上步骤4一次，弃液，在干净的吸水纸上拍干板孔内的余液；

(6)每孔加入100μl酶结合液，封板膜封板，平放置振荡器上，200～250转/分钟，室温下孵育60分钟；

(7)弃液，在干净的吸水纸上拍干板孔内余液。每孔中加入250～300μl洗涤液，静置1分钟；

(8)重复上步骤7四次，即共洗板5次；

提示：每次弃液后，需在干净的吸水纸上拍干板孔内的余液；

(9)每孔加入100μl显色液(避免强光照射)，平放置振荡器上，200～250转/分钟，室温下孵育15分钟；

提示：视梯度校准品显色情况，可适当延长或缩短显色反应时间；

(10)每孔加入100μl终止液，终止显色；

(11)在10分钟内采用酶标仪在光吸收模式下以450nm、630nm双波长测定光吸收(OD)值，设定空白对照；

(12)采用公式：OD＝OD450nm-OD630nm计算输出各微孔测定OD值。

结果如图3，从图3可以看出，试剂盒的系统线性范围r>0.99，符合样本的预期要求。

实施例4 IGFBP-1标志物的鉴定

1、提取血液中的样本

选择2例糖尿病患者进行从诊断到治疗康复过程的实时跟踪，并且以健康人做对照，用该试剂盒进行IGFBP-1的含量测定。

静脉穿刺法采集静脉血，血样采集管宜采用国标肝素钠真空采血管，血样经过滤或离心方式处理为血浆后用于检测，避免使用溶血、黄疸和脂血样本；

样本保存：24小时内用于测定时，样本可在2-8℃下暂存待测，否则，样本必须保存在-20℃或更低温度下，长期保存的样本应避免反复冻融。

2、实验前准备

(1)复温：待测样本和试剂盒在使用之前应恢复温度至室温(22～26℃)。

(2)样本稀释：所有样本在测定前，需采用样本稀释液进行3倍稀释。

(3)酶结合液：IGFBP-1抗体液与酶标液按1：1的体积比混合，涡旋至少10秒备用。混合后的酶结合液在1天内有效。

(4)显色液：底物A与底物B按1：10的体积比混合，涡旋至少10秒备用，混合后的显色液在2小时内有效。

3、检测

(1)拆封酶标板的铝箔包装，取出本次实验所需的板条。剩余部分应及时封存，避免受潮；

(2)采用单通道移液器(建议最大量程为100μl)在酶标板孔内按顺序进行加样，每孔加样量为100μl；

提示：加样时吸头可轻贴微孔下壁，以避免吸头挂液，整个加样过程要求不超过15分钟；

(3)裁剪适当大小的封板膜封板，平放置96微孔板振荡器上，调节转速在200～250转/分钟，室温下孵育60分钟；

(4)弃液，采用多通道移液器(建议最大量程为300μl)每孔中加入250～300μl洗涤液，静置1分钟；

(5)重复上步骤4一次，弃液，在干净的吸水纸上拍干板孔内的余液；

(6)每孔加入100μl酶结合液，封板膜封板，平放置振荡器上，200～250转/分钟，室温下孵育60分钟；

(7)弃液，在干净的吸水纸上拍干板孔内余液。每孔中加入250～300μl洗涤液，静置1分钟；

(8)重复上步骤7四次，即共洗板5次；

提示：每次弃液后，需在干净的吸水纸上拍干板孔内的余液；

(9)每孔加入100μl显色液(避免强光照射)，平放置振荡器上，200～250转/分钟，室温下孵育15分钟；

提示：视梯度校准品显色情况，可适当延长或缩短显色反应时间；

(10)每孔加入100μl终止液，终止显色；

(11)在10分钟内采用酶标仪在光吸收模式下以450nm、630nm双波长测定光吸收(OD)值，设定空白对照；

(12)采用公式：OD＝OD450nm-OD630nm计算输出各微孔测定OD值。

结果如图4和下表1所示：

表1

从图4和表1的结果可以看出，糖尿病患者IGFBP-1在治疗前显著性低于健康人水平，康复后恢复到正常人水平，这说明了IGFBP-1的含量与患者疾病程度成反比，IGFBP-1的正常浓度范围2327.6-2695.8pg/ml。

可见，本试剂盒准确度：对2份准确度参考品的检测，结果偏差<15.0％；线性：对线性参考品的检测，结果测量系统线性r>0.990；检测限：对20份阴性参考品检测，结果最低检测限<0.1ng/ml；精密度：批内两份各10次重复性参考品检测，结果变异系数CV<15.0％；批间两份各30次重复性参考品检测，结果变异系数CV<15.0％。

综上所述，本试剂盒评价标准为IGFBP-1的浓度在2327.6-2695.8pg/ml为正常范围，与传统的检测血糖或是脂类的试剂盒相比，更加稳定，受外界影响小，可以真实的反应患者的糖尿病状况。

申请人声明，本实用新型通过上述实施例来说明本实用新型的详细结构特征，但本实用新型并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本实用新型必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本实用新型的任何改进，对本实用新型所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本实用新型的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本实用新型的优选实施方式，但是，本实用新型并不限于上述实施方式中的具体细节，在本实用新型的技术构思范围内，可以对本实用新型的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本实用新型的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本实用新型对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本实用新型的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本实用新型的思想，其同样应当视为本实用新型所公开的内容。