双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用及方法与流程

本发明属于生物检测领域，涉及双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用，还涉及双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A的方法。

背景技术：

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是一种常见的霉菌毒素，属于2B类致癌物，它具有肾毒性、肝毒性、基因毒性、致畸性、免疫毒性和胚胎毒性，毒性仅次于AFB1。由于OTA可以广泛污染农产品和食品，尤其是霉变的谷物、咖啡、豆类以及葡萄制品，是食品安全领域危害最大的污染物之一。

目前国内外常用的OTA检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)、免疫亲和柱法(IAC)和胶体金免疫层析技术(GICT)等，检出限最低可达到0.1μg/L。

过氧草酸酯类化学发光体系是一类高效的新型化学发光体系，这种体系除了具有发光效率高，强度大，寿命长的特点外，同时还可以通过成分选择和调节，使发光强度、持续时间和颜色满足特殊需要。在各种草酸酯类试剂中，双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯(TCPO)相比之下最为稳定，所以应用更为广泛一些。目前，以TCPO-H2O2-荧光物质化学发光体系为手段的检测方法有少量报道，主要集中在兽药残留、抗生素、葡萄球菌肠毒素C1、胆固醇、生物胺以及其他化学成分的检测，而在真菌毒素检测方面尚无相关研究。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用；本发明的目的之二在于提供基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测赭曲霉毒素A的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用。

优选的，所述测定使用化学发光酶联免疫分析法。

优选的，所述化学发光是基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯─H2O2─3-(4-羟苯基)丙酸二聚体化学发光体系。

2、基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测赭曲霉毒素A的方法，包括如下步骤：在酶标板中包被赭曲霉毒素A抗原，封闭后加入OTA标准品作为竞争抗原，然后加入赭曲霉毒素A一抗，再加入酶标二抗孵育，加入过氧化脲与3-(4-羟苯基)丙酸混合液酶催化反应后，转移至另一白色酶标板中，加入含咪唑的过氧化脲，混匀后加入双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯乙腈溶液显色，酶标仪检测。

优选的，所述包被为将浓度为0.5～1.5μg/mL的BSA修饰赭曲霉毒素A加入酶标板中，4℃过夜。

优选的，所述封闭为将脱脂奶粉溶液于37℃温育1h；甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板2次，每次3min，所述脱脂奶粉溶液为每1.0g脱脂奶粉溶于20mL PBST的溶液。

优选的，所述一抗使用浓度为稀释10000～40000倍。

优选的，所述酶标二抗孵育为将HRP标记的羊抗鼠抗体稀释2000～4000倍，温育，甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板5次，每次至少3min。

优选的，所述酶催化反应为将过氧化脲与3-(4-羟苯基)丙酸混合，控制pH值为6.0，温育5～30min；混合后所述过氧化脲浓度为5.0×10^-3～13×10^-3mol/L；所述3-(4-羟苯基)丙酸浓度为5×10^-3～13×10^-3mol/L。

优选的，所述显色为加入含咪唑的过氧化脲溶液，溶液中过氧化脲浓度为0.5～4mol/L，所述咪唑浓度为2×10^-3mol/L，混匀后加入浓度为5～20×10^-3mol/L的双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯乙腈溶液。

本发明的有益效果在于：本发明基于TCPO-H2O2-PHPPA Dimer体系的化学发光酶联免疫检测方法，将其首次应用于真菌毒素赭曲霉毒素的检测；本发明通过酶联免疫分析法，辣根过氧化物酶催化过氧化脲氧化3-(4-羟苯基)丙酸(PHPPA)，生成能发荧光的3-(4-羟苯基)丙酸二聚体(PHPPA Dimer)。进而在乙腈介质中，在增强剂咪唑的参与下，同双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯和过氧化脲反应产生强化学发光；并且通过合理选择有机溶剂、避免水相体系的引入，解决过氧化草酸酯发光试剂难溶于水的问题，该方法的IC50为554.62ng/L，线性回归方程为y＝45.418-35.33x，检测范围48.94～6084.45ng/L，最低检测限14.69ng/L，葡萄干样品的平均回收率为84.55％-91.36％，葡萄汁样品的平均回收率为73.32％-87.％。该方法的平均批内变异系数为4.40％，批间变异系数为7.37％，均小于10％，表明精密度较好。用该方法获得的结果与传统的酶联免疫分析法和鲁米诺化学发光分析方法进行了比较，得到了更为理想的结果。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为不同包被浓度对icCLEIA的影响。

图2为单抗浓度对icCLEIA的影响。

图3为酶标二抗稀释度对icCLEIA的影响。

图4为过氧化脲浓度对icCLEIA的影响。

图5为PHPPA浓度对icCLEIA的影响。

图6为酶反应时间对icCLEIA的影响。

图7为TCPO浓度对icCLEIA的影响。

图8为过氧化脲乙腈溶液浓度对icCLEIA的影响。

图9为icCLEIA标准工作曲线(n＝3)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明实施例所用仪器如下：恒温培养箱(长城科工贸有限公司)、Syneng H1MG多功能酶标仪(Gene Company Limited公司)、pHS-4C酸度计(上海科学仪器公司)、JS系列电子天平(精度0.0001g)(上海精天电子仪器有限公司)、HJ-3恒温数显磁力搅拌器(江苏科析有限公司)、单通道、多通道移液器(德国Eppendorf公司)、96孔可拆化学发光酶标板(上海生工生物有限公司)。

所用试剂如下：双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯(TCPO)、3-(4-羟苯基)丙酸(PHPPA)、过氧化脲(CH4N2O·H2O2)均购于美国sigma公司，赭曲霉毒素A标准品(新加坡Pribolab公司)、赭曲霉毒素A单克隆抗体、抗原(北京沫之东生物技术有限公司)、羊抗小鼠IgG-HRP(武汉博士德公司)、咪唑(天津市远航化学品有限公司)，乙腈、HCl、Na2CO3、NaHCO3、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、Tween-20(成都科龙化工试剂公司)，脱脂奶粉、葡萄汁、葡萄干(购于本地超市)，所有试剂均为分析纯，水为超纯水。

包被缓冲液(CBS)是pH 9.6 0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液；pH7.4 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)通过溶解0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，8.0g NaCl，0.2g KCl在1升水中制得；洗涤液(PBST)为含有0.05％Tween-20的0.01mol/L PBS缓冲液溶液。过氧化脲和PHPPA工作液用pH 6.0PBS按照一定比例稀释而成。TCPO，CH4N2O·H2O2(含咪唑)工作液是用无水乙腈稀释至所需浓度。

实施例1

构建检测赭曲霉毒素A(OTA)的化学发光酶联免疫分析法(icCLIA)，具体步骤如下：

(1)包被：包被缓冲液CBS稀释包被原OTA-BSA至1.0μg/mL，加入96孔白色酶标板中，每孔100μL，4℃过夜；甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板2次，每次3min。

(2)封闭：称取1.0g脱脂奶粉溶于20mL PBST溶液中，每孔200μL，37℃温育1h，甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板2次，每次3min。

(3)竞争：用PBS将OTA标准品从100ng/mL开始倍比稀释，共稀释14个梯度(100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.5625ng/mL、0.78125ng/mL、0.390625ng/mL、0.195313ng/mL、0.097656ng/mL、0.048828ng/mL、0.024414ng/mL、0.012207ng/mL)，每个浓度梯度做3个重复孔，每孔50μL，零标准品孔和空白孔用PBS代替；PBST将单抗稀释至10000倍，每孔50μL，空白孔用PBST代替，37℃温育0.5h；甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板2次，每次3min。

(4)二抗：PBST稀释酶标二抗(IgG-HRP)4000倍，每孔100μL，37℃温育1h，甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板5次，每次3min。

(5)酶催化反应：过氧化脲PBS溶液(7.0×10^-3mol/L)与PHPPA PBS溶液(7.0×10^-3mol/L)等体积混合，每孔100μL，37℃温育10min。

(6)转移：用多通道移液器从各反应孔中移取50μL反应后的酶催化产物至另一白色酶标板，注意一一对应。

(7)显色：2mL 1mol/L过氧化脲乙腈溶液与4μL 1mol/L咪唑母液混合，每孔25μL，混匀后加入1×10^-2mol/L TCPO乙腈溶液，每孔25μL。

(8)读数：立即放入酶标仪，记录化学发光信号。

(9)数据处理：以OTA浓度的对数为横坐标，各OTA浓度对应的RLU平均值(RLU)与零标准品孔的RLU(RLUmax)的比值为纵坐标，绘制竞争曲线。

icCLEIA工作参数优化：

(1)包被原浓度

包被缓冲液将OTA-BSA分别稀释至2.0μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL包被酶标板，4℃冰箱过夜，其余步骤按照上述操作。不同包被浓度结果如图1所示，结果显示OTA-BSA包被浓度越小，OTA标准品竞争结合特异性抗体越多，洗板后残留的抗体越少，发光强度越低，IC50随OTA-BSA包被浓度增加先下降后上升，RLUmax/IC50在包被浓度为1.0μg/mL时最大。RLUmax/IC50越大，IC50越低，说明方法的检测效果越好，故选择OTA-BSA包被浓度为1.0μg/mL。产生上述结果的主要原因是包被原浓度过高，不仅浪费抗原而且容易产生多层抗原吸附，在操作过程中脱落从而降低敏感性和重复性；包被原浓度过低，固相载体上结合的抗原量小，后续反应结合的抗体量减少。

(2)单抗稀释倍数

用PBST将单抗稀释至2500、5000、10000、20000、40000倍，50μL/孔，其余步骤按照上述操作。一抗浓度与酶标二抗结合量有关，从图2可以看出，一抗浓度稀释倍数越高，其与HRP标记的二抗特异性结合量减少，TCPO体系发光信号降低，故RLUmax随一抗稀释倍数的增加而不断下降；而一抗浓度过大，竞争反应效果不明显，IC50值在一抗稀释倍数低于10000倍时迅速上升，RLUmax/IC50在稀释倍数为10000倍时最高，故选择一抗稀释倍数为10000倍。

(3)酶标二抗稀释倍数

将HRP标记的羊抗鼠抗体分别用PBST缓冲液稀释2000、3000、4000、5000、6000和7000倍，100μL/孔，37℃温育1h，其余步骤按照上述操作。不同稀释倍数结果如图3所示，从图3可以看出，酶标二抗稀释倍数越高，HRP的浓度越低，RLUmax逐渐减小；HRP浓度过低，整体发光信号减弱，竞争反应效果不明显，IC50先降低后上升；酶标二抗稀释4 000倍时RLUmax/IC50值高于其他稀释度且敏感性高，故选择二抗稀释倍数为4 000。产生上述结果的原因是酶标二抗浓度过高，易发生非特异性结合且洗板时不易完全洗脱过量未结合二抗，导致本底增加；二抗浓度过低，发光信号不强，信号放大倍数降低，方法敏感性差。

(4)HRP酶反应条件优化

A、过氧化脲与PHPPA的浓度

pH6PBS稀释过氧化脲为30×10^-4mol/L、50×10^-4mol/L、70×10^-4mol/L、90×10^-4mol/L、110×10^-4mol/L、130×10^-4mol/L，稀释PHPPA为30×10^-4mol/L、50×10^-4mol/L、70×10^-4mol/L、90×10^-4mol/L、110×10^-4mol/L、130×10^-4mol/L，其余步骤按照上述操作，结果如图4和5所示。结果显示，过氧化脲浓度低于50×10^-4mol/L时，该方法的发光强度低，无法达到增强检测灵敏度的效果；而当过氧化脲浓度高于70×10^-4mol/L时，体系发光强度增加不明显，且IC50值略有上升；随着PHPPA浓度的增加，发光强度逐渐增大，IC50呈现先降低后增加的趋势。因此，当CH4N2O·H2O2浓度为70×10^-4mol/L，PHPPA浓度为70×10^-4mol/L时，能获得最大的发光信噪比。

B、酶反应时间

过氧化脲与PHPPA等体积混合，每孔100μL，37℃温育5min、10min、15min、20min，其余步骤按照上述操作。结果见图6，结果显示，酶反应时间则以10min为宜，低于10min化学发光强度较低，孵育时间长于10min，化学发光强度增加缓慢而IC50逐渐上升。

(5)化学发光条件优化

A、TCPO乙腈溶液浓度

配制不同浓度的TCPO乙腈溶液，2.5、5、10、20、40(×10^-3mol/L)进行试验，其余步骤按照上述操作，结果如图7所示。由图7可知，TCPO浓度越大，体系发光强度越大，但背景值也不断增加，掩盖目标物发光信号；IC50在TCPO浓度为1×10^-2mol/L降到最低值后开始上升，RLUmax/IC50值在1×10^-2mol/L时最大，故选择TCPO乙腈溶液浓度为1×10^-2M。上述结果表明TCPO添加量过多或过少，均会导致不同标准品浓度孔间酶催化产生的发光信号变化减小，竞争抑制曲线下降趋势减缓，IC50增大。

B、过氧化脲乙腈溶液浓度

配制不同浓度的过氧化脲乙腈溶液，0.25mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、4mol/L进行试验，其余步骤按照上述操作，结果如图8所示。结果显示，当过氧化脲乙腈溶液浓度低于1mol/L时，IC50的变化明显，当过氧化脲乙腈溶液高于1mol/L，IC50值缓慢上升；RLUmax随着过氧化脲乙腈溶液浓度增加而上升，最终确定过氧化脲乙腈溶液浓度为1mol/L。

(6)icCLEIA的标准工作曲线

根据(1)-(5)选择的条件参数，按照上述操作步骤进行检测，以OTA浓度的对数值lgC为横坐标，各标准品孔发光强度RLU与最大发光值RLUmax的比值为纵坐标，每个梯度做3个重复，绘制icCLEIA方法的标准曲线(图9)，根据线性回归方程计算出该方法的IC50值和线性范围(IC20～IC80)，其线性回归方程为y＝45.418-35.33xy＝23.67-26.06x，R²＝0.9955，经计算得该方法检测的线性范围48.94～6084.45ng/L，IC50为554.62ng/L。

(7)icCLEIA方法评价

A.最低检出限

用icCLEIA测定10个不同批次零标准品孔的RLU值，计算平均值(X)和标准差(SD)，按照公式LOD％＝(X-2SD)/X×100％进行计算，根据标准曲线方程计算对应的OTA质量浓度为该方法理论检出下限，经计算最低检出限为14.69ng/L。

B.准确度

称取5.0g葡萄干样品于50mL离心管中，除空白组外分别将2μg、20μg、40μg OTA标准品，加入30mL甲醇-水溶液(甲醇：水＝1：1，含4％NaCl)，涡旋震荡20min，用快速定性滤纸过滤，用PBS缓冲液将滤液稀释N(50)倍后，分别取50μL滤液进行检测。实测浓度除以添加的浓度即为回收率，结果如表1所示。

移取5.0mL葡萄汁样品于15mL尖底离心管中，除空白组外分别加入1μg、10μg、20μgOTA标准品，加冰乙酸调节pH为3.5，然后快速注入100μL[C8MIM][PF6]与0.8mL丙酮的混合溶液，涡旋震荡3min，形成雾状溶液，4000r/min离心5min，最后准确移取30μL离心管底部的离子液体，PBS缓冲液稀释N(100)倍后用icCLEIA检测，并计算回收率，结果如表1所示。

表1.葡萄干、葡萄汁样品添加回收试验(n＝3)

由表1可以看出，葡萄干样品的平均回收率为84.55％-91.36％，葡萄汁样品的平均回收率为73.32％-87.％。

1.5.3精密度

以批内变异和批间变异衡量精密度，以选取6个不同批次试剂盒，检测不同OTA标准品孔的RLU值，同一批次同一浓度做6个重复孔，计算批内变异系数和批间变异系数。变异系数(Coefficient of variation,CV)计算公式为：

CV(％)＝(SD/X)×100

其中Xi为样品孔RLU值

X为样品孔平均RLU值

N为样本数量

结果如表2和3所示。

表2批内变异系数

表3批间变异系数

结果显示，该方法的平均批内变异系数为4.40％，批间变异系数为7.37％，均小于10％，表明精密度较好。

综上，与传统的酶联免疫分析和鲁米诺化学发光体系相比较，采用草酸酯化学发光体系更加灵敏且有更高的发光量子产率，有利于提高免疫分析方法的灵敏度。在本实验中，使用高特异性的单克隆抗体和和超灵敏的化学发光体系TCPO–CH4N2O·H2O2–PHPPA Dimer，TCPO化学发光体系基于酶联免疫分析和辣根过氧化物酶催化荧光反应，已经成功用于赭曲霉毒素A含量的测定。结果表明其可以显著增强测定灵敏度，该方法的IC50为554.62ng/L，线性回归方程为y＝45.418-35.33x，检测范围48.94～6084.45ng/L，最低检测限14.69ng/L，葡萄干样品的平均回收率为84.55％-91.36％，葡萄汁样品的平均回收率为73.32％-87.％。该方法的平均批内变异系数为4.40％，批间变异系数为7.37％，均小于10％，表明精密度较好。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。