一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒的制作方法

本实用新型涉及医学免疫体外诊断试剂领域，具体涉及一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒。

背景技术：

血管内皮细胞生长因子(VEGF)是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，是一种有高度特异性的促进血管内皮细胞分裂，诱导血管新生的因子，它可以特异地作用于血管内皮细胞，促进血管生成，维持血管的正常状态和完整性，提高血管通透性。血管内皮细胞生长因子参与许多病理和生理的表达，在参与骨折愈合的表达全过程中起到重要因素，在糖尿病肾病的发病过程中会表达增强，另外在对白血病和严重肢体缺血的表达中可作为一种基因治疗的药物。研究发现，VEGF在许多病理生理过程中都有表达，例如创伤修复中的血管内皮细胞和巨噬细胞、糖尿病视网膜病变细胞、心脑血管病和肝脏疾病等，并以自分泌、旁分泌和胞内分泌的方式特异地作用于血管内皮细胞膜上的VEGF受体从而引发细胞内信号转导而实现的。在众多血管生成因子当中，VEGF是公认的主要的诱导血管生成的物质，它能强烈地促进血管内皮有丝分裂和新生血管形成。

现有技术血管内皮细胞生长因子的检测方法主要有酶联免疫法、时间分辨荧光免疫分析法、化学发光法等，然而这些方法具有线性范围窄，检测时间长等缺点，无法满足临床需求。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，填补了市场上血管内皮细胞生长因子化学发光试剂盒的空白，具有检测结果灵敏度高、检测范围宽等优点。

为实现上述目的，本实用新型提供如下技术方案：

一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，包括试剂以及盛放试剂的试剂盒盒体，所述试剂包括酶标抗体、化学发光底物、浓缩洗涤液、稀释液、标准品溶液，所述试剂盒盒体的截面为圆柱形结构，所述试剂盒盒体包括盒下体、盖体，盒下体为上端敞开的腔室，盖体与盒下体通过螺纹连接，盒下体的直径为d2,盒下体内设有防震垫、固定座，防震垫为上端敞开的圆柱形结构，固定座位于防震垫内固定座的上端高于防震垫的上端，固定座内设有放置试剂瓶的第一盲孔、第二盲孔、第三盲孔，第一盲孔位于固定座的中间位置，第二盲孔、第三盲孔分别位于第一盲孔的两侧，第一盲孔内分别盛放浓缩洗涤液、稀释液，第二盲孔内分别盛放酶标抗体、化学发光底物，第三盲孔内盛放标准品溶液，所述盖体下表面粘有微孔板盒，微孔板盒内为微孔板，盖体上表面设有第一凹槽，第一凹槽内设有第二凹槽，第一凹槽的截面为圆形结构，第一凹槽的直径为d1,d1＝d2,第二凹槽的截面为长方形结构，第二凹槽内设有可90°旋转的折叠把手。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述盒下体的上端外侧设有外螺纹，盖体的内表面下端设有内螺纹，内螺纹与外螺纹相匹配。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述试剂盒盒体为聚丙烯材质。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述防震垫为海绵材质。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述固定座为聚丙烯材质。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述微孔板为聚丙乙烯材质。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述盖体的内径为d3，d3＝d2＝d1。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述微孔板包被VEGF单克隆抗体，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的VEGF单克隆抗体，化学发光底物液A为含有4ug/mL对碘苯酚、6.5mg/mL鲁米诺的Tris-HCl缓冲液(0.1M、pH＝8.5)，化学发光底物液B为含有80mg/mL过氧化氢、20mg/mL辣根过氧化氢酶的柠檬酸缓冲液(0.1M、pH＝4.5)。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述稀释液是将150ml牛血清白蛋白、25ml重量百分比浓度为1％的硫柳汞、10ml浓度为0.1M铁氰化钾、0.5ml的吐温-20、15ml浓度为10mg/ml的庆大霉素、80ml的Proclin-300，余量为PBS缓冲液(0.01M、pH＝7.5)定容至1000ml混合得到的溶液。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液是将重量为2.9g的NaH2PO4·2H2O、重量为29g的Na2HPO4·12H2O、重量为250g的NaCl、80ml的Proclin-300和20ml吐温-20，加双蒸水定容至1000ml混合得到的溶液。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述标准品溶液为6个浓度梯度的VEGF抗原，所述浓度依次为：0pg/ml、30pg/ml、125pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml。

本试剂盒使用时还需用到包被缓冲液、封闭液，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(0.03mol/L、pH＝9.6)，所述封闭液是将0.02g叠氮化钠、15g牛血清白蛋白和120mL浓度为0.03mol/L磷酸盐溶液(pH＝7.5)混合得到的溶液。

本实用新型具有有益效果：

(1)本实用新型试剂盒盒体为圆柱形结构，较方形试剂盒更加美观，整体结构更加稳定，并且成形方便，降低制备成本，运输时不易损坏，盒下体内设有海绵材质的防震垫，固定座位于防震垫内，提高检测试剂盒的整体使用安全性，试剂在受到外界压力时不会轻易损坏，盖体与盒下体通过螺纹连接，连接牢固，盖体上表面设有第一凹槽，第一凹槽的直径与盒下体相同，便于试剂盒堆放，节省空间，第二凹槽内设有折叠把手，使用时可以方便的拿取试剂盒，不使用时折叠把手位于第二凹槽内，也不会对堆放试剂盒造成影响，固定座内放置试剂瓶，装配方便，便于用户进行检测操作；

(2)本实用新型辣根过氧化物酶标记的VEGF单克隆抗体与微孔板上包被的VEGF单克隆抗体和待测样品形成“固相包被抗体-待测抗原-酶标抗体”的夹心复合物结构，本实用新型采用双抗体夹心法和酶催化化学发光免疫分析相结合，有效地利用了化学发光技术原理，应用辣根过氧化物酶催化发光底物鲁米诺，检测鲁米诺产生的光信号，灵敏度大大提高，本试剂盒体系中所采用的各溶液配方是该反应体系下的最优方案，本试剂盒线性范围宽，线性关系良好，准确度高批内和批间差均符合检测标准，准确程度优于目前市场上其它类型的VEGF试剂盒，检测效率高。

附图说明

图1为本实用新型试剂盒盒体结构示意图；

图2为盒下体示意图；

图3为固定座、防震垫示意图；

图4为固定座示意图；

图5为图1中A-A剖面示意图；

图中：1-试剂盒盒体，2-盒下体，3-盖体，4-防震垫，5-固定座，6-第一盲孔，7-第二盲孔，8-第三盲孔，9-微孔板盒，10-第一凹槽，11-第二凹槽，12-折叠把手，13-试剂。

具体实施方式

下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、化学发光试剂盒的结构

如图1-5所示，一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，包括试剂以及盛放试剂的试剂盒盒体，所述试剂包括酶标抗体、化学发光底物、浓缩洗涤液、稀释液、标准品溶液，所述试剂盒盒体的截面为圆柱形结构，所述试剂盒盒体包括盒下体、盖体，盒下体为上端敞开的腔室，盖体与盒下体通过螺纹连接，盒下体的直径为d2,盒下体内设有防震垫、固定座，防震垫为上端敞开的圆柱形结构，固定座位于防震垫内固定座的上端高于防震垫的上端，固定座内设有放置试剂瓶的第一盲孔、第二盲孔、第三盲孔，第一盲孔位于固定座的中间位置，第二盲孔、第三盲孔分别位于第一盲孔的两侧，第一盲孔内分别盛放浓缩洗涤液、稀释液，第二盲孔内分别盛放酶标抗体、化学发光底物，第三盲孔内盛放标准品溶液，所述盖体下表面粘有微孔板盒，微孔板盒内为微孔板，盖体上表面设有第一凹槽，第一凹槽内设有第二凹槽，第一凹槽的截面为圆形结构，第一凹槽的直径为d1,d1＝d2,第二凹槽的截面为长方形结构，第二凹槽内设有可90°旋转的折叠把手。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述盒下体的上端外侧设有外螺纹，盖体的内表面下端设有内螺纹，内螺纹与外螺纹相匹配。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述试剂盒盒体为聚丙烯材质。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述防震垫为海绵材质。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述固定座为聚丙烯材质。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述微孔板为聚丙乙烯材质。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述盖体的内径为d3，d3＝d2＝d1。

本实用新型试剂盒盒体为圆柱形结构，较方形试剂盒更加美观，整体结构更加稳定，并且成形方便，降低制备成本，运输时不易损坏，盒下体内设有海绵材质的防震垫，固定座位于防震垫内，提高检测试剂盒的整体使用安全性，试剂在受到外界压力时不会轻易损坏，盖体与盒下体通过螺纹连接，连接牢固，盖体上表面设有第一凹槽，第一凹槽的直径与盒下体相同，便于试剂盒堆放，节省空间，第二凹槽内设有折叠把手，使用时可以方便的拿取试剂盒，不使用时折叠把手位于第二凹槽内，也不会对堆放试剂盒造成影响，固定座内放置试剂瓶，装配方便，便于用户进行检测操作。

实施例2、化学发光试剂盒的组成

本试剂盒包括述浓缩洗涤液、稀释液、酶标抗体、化学发光底物液A、化学发光底物液B、标准品溶液、包被缓冲液、封闭液。

所述微孔板包被VEGF单克隆抗体，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的VEGF单克隆抗体，化学发光底物液A为含有4ug/mL对碘苯酚、6.5mg/mL鲁米诺的Tris-HCl缓冲液(0.1M、pH＝8.5)，化学发光底物液B为含有80mg/mL过氧化氢、20mg/mL辣根过氧化氢酶的柠檬酸缓冲液(0.1M、pH＝4.5)。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述稀释液是将150ml牛血清白蛋白、25ml重量百分比浓度为1％的硫柳汞、10ml浓度为0.1M铁氰化钾、0.5ml的吐温-20、15ml浓度为10mg/ml的庆大霉素、80ml的Proclin-300，余量为PBS缓冲液(0.01M、pH＝7.5)定容至1000ml混合得到的溶液。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液是将重量为2.9g的NaH2PO4·2H2O、重量为29g的Na2HPO4·12H2O、重量为250g的NaCl、80ml的Proclin-300和20ml吐温-20，加双蒸水定容至1000ml混合得到的溶液。

上述一种血管内皮细胞生长因子化学发光检测试剂盒，其中，所述标准品溶液为6个浓度梯度的VEGF抗原，所述浓度依次为：0pg/ml、30pg/ml、125pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml。

本试剂盒使用时还需用到包被缓冲液、封闭液，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(0.03mol/L、pH＝9.6)，所述封闭液是将0.02g叠氮化钠、15g牛血清白蛋白和120mL浓度为0.03mol/L磷酸盐溶液(pH＝7.5)混合得到的溶液。

实施例3、试剂盒的制备方法

以VEGF阳性血清配制标准品，微孔板包被VEGF单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记VEGF单克隆抗体，配制化学发光底物液A和B，配制浓缩洗涤液和稀释液，分装上述组份，组装为成品。

(1)包被：用30mM pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成包被浓度为2ug/ml的VEGF单克隆抗体包被缓冲液，并将包被缓冲液负载于微孔板(100ul/孔)，2-8℃包被18-24小时。

(2)封闭：用0.02g叠氮化钠、15g牛血清白蛋白和120mL浓度为0.03mol/L磷酸盐溶液(pH＝7.5)混合得到的封闭液封闭上述洗涤后的微孔板。

(3)酶标抗体：取HRP 5mg溶于0.2mol/L，pH＝5.6醋酸盐缓冲液1ml中，加入1％DNFB无水乙醇溶液0.1ml，室温下轻微搅拌1h，加入新鲜配置的0.1mol/LNaIO4 0.5ml，此时溶液由原棕色变为墨绿色，4℃放置30min，此时溶液由原棕色变为墨绿色，加入2.5％乙二醇1ml，室温下轻微搅拌1h，终止反应，加入待标记的抗体5-10mg，用1mol/L，pH＝9.5碳酸盐缓冲液，调节pH值至9.0，混匀，置4℃过夜；加入硼氢化钠溶液0.1ml，混匀，4℃放置3h，对0.01mol/L，pH＝7.4磷酸盐缓冲液，4℃透析过夜，换液3次，3000r/min离心30min，去除沉淀物，收集上清液即为酶标抗体。

(4)化学发光底物：化学发光底物液A为含有4ug/mL对碘苯酚、6.5mg/mL鲁米诺的Tris-HCl缓冲液(0.1M、pH＝8.5)，化学发光底物液B为含有80mg/mL过氧化氢、20mg/mL辣根过氧化氢酶的柠檬酸缓冲液(0.1M、pH＝4.5)。

(5)稀释液：将150ml牛血清白蛋白、25ml重量百分比浓度为1％的硫柳汞、10ml浓度为0.1M铁氰化钾、0.5ml的吐温-20、15ml浓度为10mg/ml的庆大霉素、80ml的Proclin-300，余量为PBS缓冲液(0.01M、pH＝7.5)定容至1000ml混合得到的稀释液。

(6)浓缩洗涤液：将重量为2.9g的NaH2PO4·2H2O、重量为29g的Na2HPO4·12H2O、重量为250g的NaCl、80ml的Proclin-300和20ml吐温-20，加双蒸水定容至1000ml混合得到浓缩洗涤液。

(7)包被缓冲液：为碳酸盐缓冲液(0.03mol/L、pH＝9.6)。

(8)封闭液：将0.02g叠氮化钠、15g牛血清白蛋白和120mL浓度为0.03mol/L磷酸盐溶液(pH＝7.5)混合得到封闭液。

实施例4、本试剂盒的使用方法

(1)从2-8℃冰箱中取出包被后的微孔板，室温放置15分钟。

(2)设标准品各2孔每孔50ul，待测样本50ul，振荡混匀后37℃温育30分钟。

(3)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

(4)每孔分别加入100uL酶标抗体，37℃温育20分钟。

(5)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

(6)每孔加化学发光底物液A、B各50μL，用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(20～25℃)避光反应5分钟。

(7)必须于加化学发光底物液后的第5～20分钟内测量，在化学发光测量仪上测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。

尽管已经示出和描述了本实用新型的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本实用新型的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本实用新型的范围由所附权利要求及其等同物限定。