拉莫三嗪的检测方法与流程

本发明涉及生物检测
技术领域：
，特别涉及拉莫三嗪的检测方法。
背景技术：
：拉莫三嗪为苯基三嗪类化合物，可抑制兴奋性神经递质的释放和钠离子通道，为白色结晶性粉末，在水中不溶。目前，检测样品中拉莫三嗪含量通常采用的方法为液相色谱法。而现有检测方法通常采用单一色谱柱进行检测，增加了等待色谱柱清洗的时间，从而导致样品检测时间较长。技术实现要素：本发明提供了拉莫三嗪的检测方法，能够缩短样品检测时间。为了解决上述问题，本发明实施例提供了拉莫三嗪的检测方法，包括：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有拉莫三嗪和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中拉莫三嗪的浓度和内标物的浓度，拟合拉莫三嗪的标准曲线方程；对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入氢氧化钠溶液和萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中拉莫三嗪的浓度。优选地，为了更准确地检测出待测样品中拉莫三嗪的浓度，标准溶液和待测样品中的内标物均为盐酸普萘洛尔。需要说明的是，第一上清液包括血清或血浆；萃取后选择为上层有机相。具体地，可以通过下述步骤制备标准溶液：(1)标准储备液的配制精确称取拉莫三嗪标准品置于容量瓶中，用甲醇进行溶解，并定容至容量瓶标线，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存。(2)标准工作液的配制取适量步骤(1)中标准储备液，用含有50％-70％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有4-400μg/ml拉莫三嗪的标准工作液，并在-80℃条件下保存。(3)内标储备液的配制取内标物盐酸普萘洛尔标准品置于容量瓶中，用甲醇进行溶解，并定容至容量瓶的标线，得到内标储备液，并在-80℃条件下保存。(4)内标工作液的配制取步骤(3)中内标储备液，用含有50％-70％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释，得到含盐酸普萘洛尔的内标工作液，并在-80℃保存。(5)标准溶液的标定分别移取步骤(2)中不同浓度的标准工作液和步骤(4)中的内标工作液置于离心管中，分别向各个离心管中加入空白样本，混合制成至少三种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为1500-2500rpm下涡旋混匀2-5min后，顺次加入氢氧化钠溶液和萃取剂进行萃取，得到标准溶液。需要说明的是，空白样本为未含有拉莫三嗪的血清或血浆。为了保证拉莫三嗪和盐酸普萘洛尔充分溶解，选择甲醇溶液进行溶解，同时为了降低标准工作液和内标工作液反复使用过程中的挥发，确保标准工作液和内标工作液的稳定性，所以拉莫三嗪和盐酸普萘洛尔的稀释液为含有50％-70％甲醇的水溶液。优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：洗脱流动相中的水相包括：含有40-100mm乙酸铵和0.1％-0.15％甲酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：甲醇溶液；柱温包括35-45℃；流速包括0.85-1.25ml/min。具体地，色谱柱包括thermo公司的acclaimtm120-c18色谱柱，长度为150mm、内径为4.6mm以及填料粒径为5μm的色谱柱。具体地，液相色谱仪所使用的在线过滤器为ssicolpre-filterwater1/160.5m。针对水相中的乙酸铵来说，40-100mm是指40mm至100mm范围内的任一比例，比如，40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm以及100mm。针对水相中的甲酸来说，0.1％-0.15％是指0.1％至0.15％范围内的任一值，比如，水相中含有0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％以及0.15％的甲酸。比如，洗脱流动相中的水相包括：含有50mm乙酸铵和0.12％甲酸的水溶液；有机相包括：甲醇溶液。具体地，水相中的乙酸铵浓度过大且在对目标物进行检测过程时，可能存在乙酸铵在色谱柱中析出的情况，已析出的乙酸铵会堵塞色谱柱，影响样品测试。因此，洗脱流动相中的水相包括：含有40-100mm乙酸铵。针对柱温来说，35-45℃是指35℃至45℃范围内的任一温度值，比如，35℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃以及45℃。所述检测条件中的液相条件，包括：采用双泵双柱检测模式，其中，所述双泵双柱检测模式包括：主泵、副泵和两个色谱柱；所述主泵和所述两个色谱柱中的一个色谱柱在对待测样品进行检测时，采用等度洗脱，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比包括：47％:53％-56％:44％；所述副泵用于对待测样品检测后的色谱柱进行清洗时采用梯度洗脱，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比包括：0.00min：0％:100％-10％:90％；4.90min：0％:100％-10％:90％；4.91min：47％:53％-56％:44％；8.20min：47％:53％-56％:44％。针对主泵的等度洗脱中的水相与有机相的体积比来说，47％:53％-56％:44％是指47％:53％至56％:44％范围内的任一比例，比如，47％:53％、49％:51％、50％:50％、51％:49％、52％:48％、54％:46％以及56％:44％。针对副泵的梯度洗脱中的水相与有机相在0.00min和4.90min的体积比，0％:100％-10％:90％是指0％:100％至10％:90％范围内的任一比例，比如，0％:100％、3％:97％、5％:95％、8％:92％以及10％:90％。针对副泵的梯度洗脱中的水相与有机相在4.91min和8.20min的体积比，47％:53％-56％:44％是指47％:53％至56％:44％范围内的任一比例，比如，47％:53％、49％:51％、50％:50％、51％:49％、52％:48％、54％:46％以及56％:44％。比如，水相的体积占洗脱流动相体积的51％，有机相的体积占洗脱流动相体积的49％；水相的体积占洗脱流动相体积的5％，有机相的体积占洗脱流动相体积的95％。具体地，在主泵采用等度洗脱进行检测时，当水相在洗脱流动相中体积占比小于47％时，拉莫三嗪的色谱峰与杂质峰的分离度较差，易受杂质干扰，影响待测样品的检测准确性；当水相在洗脱流动相中体积占比大于56％时，拉莫三嗪的色谱峰与杂质峰的分离度较好，但内标物出峰时间较晚，导致内标物的保留时间增大，增大了待测样品的检测时间。因此，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比包括：47％:53％-56％:44％。具体地，在副泵采用梯度洗脱进行清洗时，为了保证去除残留的目标物杂质，在0.00min和4.90min时选择洗脱流动相中水相与有机相的体积比包括：0％:100％-10％:90％。例如，在副泵采用梯度洗脱进行清洗时，当4.90min水相与有机相的比例为5％:95％，且4.91min水相与有机相的比例为51％:49％时，那么在4.90min至4.91min时间段内，水相则由占比5％逐渐增加至51％，有机相由占比95％逐渐降低至5％。由于水相与有机相在洗脱流动相中占比的总和为1，因此，当有机相在洗脱流动相中的占比增加时，水相在洗脱流动相中的占比则相应降低。优选地，所述检测条件中的紫外检测条件，包括：紫外检测器的检测波长包括：0.00min：320nm；4.70min：285nm；8.20min：320nm。具体地，当紫外检测器的检测波长仅选择320nm时，内标物的响应值较低，会影响对待检测样品的检测灵敏度；当紫外检测器的检测波长仅选择285nm时，拉莫三嗪、内标物和杂质的响应值均增强，而且杂质的响应值的增强导致了拉莫三嗪出峰处的基线不平，从而影响待测样品的检测准确性；当紫外检测器的检测波长小于285nm时，拉莫三嗪的响应值较高，但是基线噪音波动较大，导致基线不平，且内标物的响应值较低，会影响对待检测样品的检测准确性。具体地，在本发明中，拉莫三嗪的出峰时间在4.7min之前，拉莫三嗪内标物的出峰时间在4.7min之后，因此为了保证拉莫三嗪出峰时的响应值较高，且不受杂质干扰，选择0.00min-4.7min内的检测波长为320nm；为了保证内标物出峰时的响应值较高，且不受杂质干扰，选择4.70min-8.20min内的检测波长为285nm。优选地，所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中拉莫三嗪的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中拉莫三嗪的浓度与内标物的浓度的比值。具体地，若拉莫三嗪的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的x值(即自变量)时，拉莫三嗪的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)。若拉莫三嗪的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)时，拉莫三嗪的浓度与内标物的浓度的比值则为标准曲线方程的x值(即自变量)。优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，对加入内标物后的第一上清液进行萃取的萃取剂包括：含有0-95％甲基叔丁基醚的乙酸乙酯溶液。针对萃取剂中的甲基叔丁基醚来说，0-95％是指0％至95％范围内的任一值，比如，含有0％、15％、25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％以及95％的甲基叔丁基醚。优选地，为了更好的去除杂质，所述第一上清液与所述萃取剂的体积比为1:8-1:12中的任一比例。针对第一上清液和萃取剂的体积比来说，1:8-1:12是指1:8至1:12范围内的任一比例，比如，1:8、1:9、1:10、1:11以及1:12。具体地，当第一上清液的体积为100μl，那么萃取剂的体积可以是800μl至1200μl范围内的任一值。优选地，所述向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入氢氧化钠溶液和萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品，包括：向所述第一上清液内加入内标物，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合2-5min；顺次加入氢氧化钠溶液，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合2-5min，顺次加入萃取剂，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合12-20min，并在10000-15000rpm的转速下离心5-12min，移取离心后的第二上清液；利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合3-8min，并在10000-15000rpm的转速下离心5-12min，取离心后的第三上清液作为待测样品。具体地，在常温(25℃)下用氮气将移取的第二上清液吹干。具体地，在向第一上清液内加入内标物后，为了使得两者混合更均匀，可以涡旋混合，再向混合后的第一上清液内加入氢氧化钠溶液和萃取剂，并涡旋混匀，进行萃取，以通过氢氧化钠溶液提高萃取剂对混合后的第一上清液的提取回收率，然后进行离心，取离心后的第二上清液，实现将杂质和目标物分离的目的。由于利用萃取剂萃取后目标物的含量较低，因此为了便于检测，可利用氮气进行吹干，以对第二上清液进行浓缩，浓缩后再加入复溶液，并进行涡旋以使复溶液中的目标物分布均匀。针对涡旋转速来说，1500-2500rpm是指1500rpm至2500rpm范围内的任一转速，比如，1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、2000rpm、2100rpm、2200rpm、2300rpm、2400rpm以及2500rpm。针对加入内标物之后的涡旋时间和加入氢氧化钠溶液之后的涡旋时间来说，2-5min是指2min至5min范围内的任一时间，比如，2min、3min、4min以及5min。针对加入萃取剂之后的涡旋时间来说，12-20min是指12min至20min范围内的任一时间，比如，12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min以及20min。针对加入复溶液之后的涡旋时间来说，3-8min是指3min至8min范围内的任一时间，比如，3min、4min、5min、6min、7min以及8min。针对离心转速来说，10000-15000rpm是指10000rpm至15000rpm范围内的任一转速，比如，10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm以及15000rpm。针对离心时间来说，5-12min是指5min至12min范围内的任一时间，比如，5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min以及12min。优选地，所述复溶液包括：含有50％-70％甲醇的水溶液。针对复溶液来说，50％-70％是指50％至70％范围内的任一值，比如，含有50％、55％、60％、65％以及70％的甲醇。本发明提供了拉莫三嗪的检测方法，通过液相色谱仪对含有不同浓度的拉莫三嗪的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物盐酸普萘洛尔，因此，基于各种浓度标准溶液中的拉莫三嗪的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到拉莫三嗪的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理，即可得离心后的血清或血浆，顺次加入内标物、氢氧化钠溶液和萃取剂进行萃取，即可得能够检测的待测样品。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中拉莫三嗪的含量。而且无需长时间的色谱分离以及清洗再平衡的过程，耗费时间较少，从而可以实现缩短样品检测时间。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明一实施例提供的拉莫三嗪的检测方法的流程图；图2是本发明一实施例提供的待测样品中的拉莫三嗪和内标物的色谱图；图3是本发明一实施例提供的标准溶液中的拉莫三嗪和内标物的色谱图；图4是本发明一实施例提供的拉莫三嗪的线性关系图；图5是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.8ml/min时的色谱图；图6是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速1.3ml/min时的色谱图；图7是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.8ml/min时主泵的压力变化图；图8是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速1.3ml/min时主泵的压力变化图；图9是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速1.1ml/min时主泵的压力变化图；图10是本发明一实施例提供的柱温30℃，流速1.1ml/min时的色谱图；图11是本发明一实施例提供的柱温50℃，流速1.1ml/min时的色谱图；图12是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；图13是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；图14是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；图15是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为46％:54％时的色谱图；图16是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为57％:43％时的色谱图；图17是本发明一实施例提供的萃取剂为乙酸乙酯时的色谱图；图18是本发明一实施例提供的萃取剂为正己烷时的色谱图；图19是本发明一实施例提供的萃取剂为乙腈时的色谱图；图20是本发明一实施例提供的萃取剂为甲醇时的色谱图；图21是本发明一实施例提供的萃取剂为含有6％磺基水杨酸的水溶液时的色谱图；图22是本发明一实施例提供的萃取剂为含有0.5m硫酸锌的水溶液时的色谱图；图23是本发明一实施例提供的色谱柱为waters-xbridgec18时的色谱图；图24是本发明一实施例提供的色谱柱为thermoacclaimpolaradvantageⅱ时的色谱图；图25是本发明一实施例提供的色谱柱为shimadzushim-packveloxc18时的色谱图；图26是本发明一实施例提供的色谱柱为agilentextend-c18时的色谱图；图27是本发明一实施例提供的色谱柱为phenomenexkinetexevoc18时的色谱图；图28是本发明一实施例提供的内标物为盐酸赛庚啶时的色谱图；图29是本发明一实施例提供的内标物为维拉帕米时的色谱图；图30是本发明一实施例提供的检测波长为320nm时的色谱图；图31是本发明一实施例提供的检测波长为285nm时的色谱图；图32是本发明一实施例提供的检测波长为246nm时的色谱图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。目前，通常采用液相色谱仪对待测样品进行检测，待测样品采用单一检测波长，不能有效减少杂质干扰对检测结果的影响。并且，待测样品采用单一色谱柱进行检测，需要长时间的色谱分离以及清洗再平衡过程，从而使得分析时间较长。并且，待测样品采用蛋白沉淀剂或单一萃取剂，使得目标物的提取回收率较低，且易受杂质干扰，从而影响待测样品的检测准确性。基于上述问题，本发明实施例提供了拉莫三嗪的检测方法，如图1所示，包括：步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有拉莫三嗪和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；步骤102：利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中拉莫三嗪的浓度和内标物的浓度，拟合拉莫三嗪的标准曲线方程；步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；步骤105：向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入氢氧化钠溶液和萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；步骤106：利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；步骤107：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中拉莫三嗪的浓度。在本发明实施例中，通过液相色谱仪对含有不同浓度的拉莫三嗪的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物，因此，基于各种浓度标准溶液中的拉莫三嗪的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到拉莫三嗪的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理即可得离心后的血清或血浆，顺次加入内标物、氢氧化钠溶液和萃取剂进行萃取，即可得能够检测的待测样品。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中拉莫三嗪的含量。而且无需长时间的色谱分离以及清洗再平衡的过程，耗费时间较少，从而可以实现缩短样品检测时间。在本发明实施例中，步骤101中的标准溶液中还包括空白样本，可以理解的是，空白样本为未含有拉莫三嗪的血清或血浆。下面以几个实施例对拉莫三嗪的检测方法进行详细说明。实施例1：制备系列浓度的标准溶液(a)标准储备液的配制：精确称取拉莫三嗪标准品10mg置于5ml容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于5ml，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存。(b)标准工作液的配制取适量步骤(a)中标准储备液，用含有50％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有4-400μg/ml拉莫三嗪的标准工作液，并在-80℃条件下保存；其中，不同浓度的标准工作液为含有拉莫三嗪：4μg/ml、8μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的系列溶液。(c)内标储备液的配制取盐酸普萘洛尔标准品10mg置于5ml容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容至5ml，得到内标储备液，并在-80℃条件下保存。(d)内标工作液的配制取适量步骤(c)中内标储备液，用含有50％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释，得到含盐酸普萘洛尔80μg/ml的内标工作液，并在-80℃保存。(e)标准溶液的标定用移液器移取步骤(b)中七种不同浓度的标准工作液10μl、步骤(d)中的10μl内标工作液和90μl空白样本分别置于离心管中，并分别在转速为2000rpm下涡旋混匀3min，混合制成七种不同浓度的混合溶液，向上述混合溶液中分别加入氢氧化钠溶液和萃取剂进行萃取，得到七种不同浓度的标准溶液，并且七种标准溶液中的内标物的量相同。需要说明的是，可按照处理待测样品时的前处理操作，对不同浓度的标准溶液的前处理过程，即，标准溶液中的涡旋转速时间、氢氧化钠溶液、加入氢氧化钠溶液后的涡旋时间和转速、萃取剂、加入萃取剂后的涡旋时间和转速、复溶液、加入复溶液后的涡旋时间和转速以及离心转速和时间均与待测样品的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的准确度。实施例2：拟合标准曲线方程利用液相色谱仪对实施例1中七种标准溶液分别进行检测，得到七种不同浓度的拉莫三嗪的标准溶液的色谱图。从上述拉莫三嗪的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中拉莫三嗪和内标物分别对应的峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的拉莫三嗪的峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述拉莫三嗪标准工作液中的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得出权重系数a、b，权重系数a为标准曲线方程的斜率，权重系数b为标准曲线方程的截距。上述检测条件包括：色谱柱：thermo公司的acclaimtm120-c18填料粒径5μm，内径为4.6mm，长度为150mm；洗脱流动相中的水相包括：含有50mm乙酸铵和0.12％甲酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：甲醇溶液；采用双泵双柱检测模式，用于对待测样品进行检测的主泵采用等度洗脱，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为51％:49％；用于在待测样品检测后清洗色谱柱的副泵采用梯度洗脱，洗脱流动相中水相与有机相的体积比包括：0.00min：5％:95％；4.90min：5％:95％；4.91min：51％:49％；8.20min：51％:49％；柱温为40℃；流速为1.1ml/min，进样量为10μl，分析时间为8.2min。检测条件中的紫外检测条件，dad紫外检测器的检测波长包括：0.00min：320nm；4.70min：285nm；8.20min：320nm。本实施例中采用的液相色谱仪包括主泵、副泵、自动进样器、柱温箱、检测器和两个相同型号的色谱柱，其中，柱温箱中包括两个切换阀：左阀和右阀，主泵用于对待测样品进行检测，副泵用于在待测样品检测后清洗色谱柱。主泵与自动进样器相连接，左阀连接自动进样器与副泵，右阀连接检测器和废液管，两个色谱柱接在左阀和右阀之间，通过左阀和右阀的协同工作可以实现交替地选择一个色谱柱与自动进样器和检测器相连接，另一个色谱柱与副泵和废液管相连接。如此当采用双泵双柱检测模式时，可以交替实现利用两个色谱柱进行待测样品的检测，即主泵对一个色谱柱进行分析检测时，副泵对另一个色谱柱进行清洗，既保证了对色谱柱进行充分的清洗，去除色谱柱内残留的弱极性杂质，又能有效缩短待测样品整体的分析检测时间。具体地，针对两个相同型号的色谱柱：色谱柱1和色谱柱2，当色谱柱1与自动进样器和检测器连接，色谱柱2与副泵和废液管相连接时，由主泵对色谱柱1中的待测样品进行检测，由副泵对已完成待测样品检测的色谱柱2进行清洗；在色谱柱1完成待测样品的检测，色谱柱2完成清洗后，由色谱柱2与自动进样器和检测器连接，色谱柱1与副泵和废液管相连接，再由主泵对色谱柱2中的待测样品进行检测，由副泵对已完成待测样品检测的色谱柱1进行清洗，从而交替实现利用两个色谱柱进行待测样品的检测。本实施例中采用波长切换的检测方式，由于拉莫三嗪的出峰时间较早而易受到杂质的干扰，而内标物的出峰时间较晚，不易受杂质干扰，因此在拉莫三嗪出峰的过程中选择320nm以免其受杂质干扰。同时，为了避免内标物的浓度过高造成色谱柱过载，导致色谱峰峰型异常，也为了提高内标物的响应值，因此在内标物出峰的过程中选择了内标物的最大吸收波长285nm。实施例3：待测样品的前处理3.1取待处理血液至少500μl，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液血清或血浆为第一上清液，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。3.2用移液枪移取10μl实施例1中的内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入100μl步骤3.1中的血清或血浆，在2000rpm的转速下涡旋混合3min后，加入1m氢氧化钠溶液50μl，并在2000rpm的转速下涡旋混合5min后，加入萃取剂(含有95％甲基叔丁基醚的乙酸乙酯溶液)1000μl后，并在2000rpm的转速下涡旋混合15min后，再在14000rpm的转速下离心10min后，取第二上清液(上层有机相)880μl放入另一支1.5ml离心管中，在常温下利用氮气将移取的第二上清液吹干，顺次加入100μl复溶液(含有50％甲醇的水溶液)，在2000rpm的转速下涡旋混合5min，并在14000rpm的转速下离心10min，取离心后的第三上清液作为待测样品。在本发明实施例中，为了去除待处理样品中的酸性杂质成分对检测造成的干扰，同时为了保证目标物在萃取剂中的提取回收率较高，使目标物的响应值满足检测要求，因此选择加入氢氧化钠溶液进行碱化处理，通过碱化处理去除待处理样品中的酸性杂质成分，同时提高了碱性目标物的提取回收率。具体地，当使用单一萃取剂甲基叔丁基醚时，待测样品中虽然不含有杂质干扰成分，但是目标物和内标物的重现性较差，从而导致目标物和内标物的提取回收率存在波动，因此选择萃取剂为含有0-95％甲基叔丁基醚的乙酸乙酯溶液。实施例4：待测样品的检测利用液相色谱仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中拉莫三嗪的色谱峰面积和待测样品中内标物的色谱峰面积，将待测样品中的拉莫三嗪的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积作为纵坐标y1，代入到实施例2的标准曲线方程为y1＝a*x1+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中拉莫三嗪的浓度。实施例5：针对本发明的准确性的评价英国therapeuticdrugs(tdm)lgc室间比对，该项目室间比对每年进行12次，每次分三个水平的样本，12次共36个浓度的样本比对全部通过，以下为随机选取的四次实施例比对结果。由表1可知，测定结果与靶值的偏差均在10％以内，准确度良好。表1实施例6：针对检测条件的说明本申请例1：(1)色谱柱：thermo公司的acclaimtm120-c18(2)采用双泵双柱检测模式，对待测样品进行检测时采用等度洗脱，其中洗脱流动相中的水相包括：含有50mm乙酸铵和0.12％甲酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：甲醇溶液；在待测样品检测后清洗色谱柱时采用梯度洗脱；(3)流速：1.1ml/min，进样量10μl，分析时间8.2min；(4)紫外检测采用波长切换的检测方式，检测波长包括：0.00min：320nm；4.70min：285nm；8.20min：320nm。对比例1：(高效液相色谱法测定癫痫患者血浆中拉莫三嗪的浓度[j].中国医院药学杂志,2013,33(07):552-555.)(1)色谱柱：c18色谱柱(填料粒径5μm，内径为4.6mm，长度为250mm)；(2)洗脱流动相中的水相包括：含有50mm磷酸二氢钠的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；等度洗脱；(3)流速：1.0ml/min，进样量10μl，分析时间13min(4)紫外检测波长为220nm。图2为本申请中的待测样品中拉莫三嗪和内标物的色谱图，图2的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5。从图2、本申请例1和对比例1可以看出，本发明的样本分析时间为8.2min，其中拉莫三嗪的保留时间约为3.35min，拉莫三嗪内标物的保留时间约为6.28min，相较于对比例1的分析时间短。其次，本申请例1中采用双泵双柱的检测模式，可以交替实现利用两个色谱柱进行待测样品的检测，既保证了对色谱柱进行充分的清洗，去除色谱柱内残留的弱极性杂质，又能极大地缩短待测样品整体的分析检测时间。其次，本申请例1采用波长切换的检测方式，基于拉莫三嗪和内标物的保留时间分别选择不同的波长，以确保拉莫三嗪和内标物不受杂质的干扰，同时保证内标物的响应值，从而提高了待测样品的检测准确性。实施例7：拉莫三嗪的检测方法的检出限和定量限制备不同浓度的拉莫三嗪低浓度样本，分别加入10μl内标工作液，加入10μl各个浓度的拉莫三嗪低浓度样本和90μl空白样本，混匀后按本实施例3中的前处理以及实施例2中的检测条件进行检测，其中，本实施例中按照浓度由低至高的顺序进行检测，避免检测时浓度高的样本对浓度低的样本产生影响。然后以定量色谱峰面积-浓度作图，得到拉莫三嗪的标准曲线，结果表明拉莫三嗪的检出限和定量限分别如下：(1)检出限(lod)：0.05μg/ml，信噪比(s/n)为3；(2)定量限(loq)：0.16μg/ml，信噪比(s/n)为10。由本实施例可知，拉莫三嗪的检出限及定量限分别为0.05μg/ml和0.16μg/ml，灵敏度很高，对拉莫三嗪含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。实施例8：拉莫三嗪的检测方法的线性方程的获得和线性关系将实施例1中七种不同浓度的标准溶液利用液相色谱仪按照实施例2中的检测条件进行测定，得到各浓度的拉莫三嗪及内标物的色谱图，其中，标准溶液中的拉莫三嗪和内标物的色谱图如图3所示；图3的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5；其中，拉莫三嗪的保留时间约为3.39min，拉莫三嗪内标物的保留时间约为6.37min。确定各色谱峰峰面积，以拉莫三嗪色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，拉莫三嗪浓度与内标物浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x2，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y2＝a*x2+b，并且得系数c；线性方程的测定结果见表2，线性方程图见图4。表2检测指标线性范围线性方程相关系数加权拉莫三嗪-某实施例10.4-40μg/mly2＝6.7813*x2+0.09630.99991/x2表2为一次实施例中的线性关系数据，由表2可知，拉莫三嗪在0.4-40μg/ml的线性范围内，相关系数r2＞0.9900，线性关系良好。实施例9：拉莫三嗪的检测方法的回收率和精密度取实施例1中拉莫三嗪标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例2中的检测条件进行测定，重复分析测定3批次，拉莫三嗪的回收率如表3。拉莫三嗪在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为94.29％～101.58％，精密度为0.69％～2.40％。表3综合上述验证试验，本实施例的回收率，检出限和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法检测血液中拉莫三嗪，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。由图2和图3可见，待测样品中的拉莫三嗪的保留时间与其标准溶液中的拉莫三嗪的保留时间一致，该方法以盐酸普萘洛尔为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。实施例10：针对流速和柱温的说明图5至图11分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为流速和柱温不同，其中，图7至图9中的横坐标均为采集时间(min)，纵坐标均为压强大小(bar)。图5为柱温40℃，流速0.8ml/min时的色谱图，图5中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5，图5中保留时间约为4.47min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为8.2min的色谱峰为内标物的色谱峰；图6为柱温40℃，流速1.3ml/min时的色谱图，图6中的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为0.5，图6中保留时间约为2.82min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为5.2min的色谱峰为内标物的色谱峰；图7为柱温40℃，流速0.8ml/min时主泵的压力变化图，图7中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5；图8为柱温40℃，流速1.3ml/min时主泵的压力变化图，图8中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为1.0；图9为柱温40℃，流速1.1ml/min时主泵的压力变化图，图9中的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为1.0；图10为柱温30℃，流速1.1ml/min时的色谱图，图10中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5，图10中保留时间约为3.70min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为7.25min的色谱峰为内标物的色谱峰；图11为柱温50℃，流速1.1ml/min时的色谱图，图11中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5，图11中保留时间约为3.00min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为5.40min的色谱峰为内标物的色谱峰。通过图2以及图5至图11可见，当流速为1.1ml/min，柱温低于35℃时，拉莫三嗪和内标物的保留时间增加，导致目标物的检测时间过长，影响待测样品的检测时效性。而柱温高于45℃时，拉莫三嗪和内标物的保留时间有所减小，但是柱温较高则会影响色谱柱寿命，因此，对于拉莫三嗪和内标物检测时的柱温范围设置在35℃至45℃范围内，以使目标物的保留时间相对最短。由于流速小于0.85ml/min时会使得拉莫三嗪和内标物的出峰较晚，保留时间增加，从而导致目标物检测时间过长，影响待测样品的检测效率和时效性。而流速大于1.25ml/min时，拉莫三嗪和内标物出峰较早，保留时间较短，存在受基质干扰的风险，同时流速过大会使柱压升高，超过色谱柱所能承受的压力，对色谱柱造成不可逆的损伤。实施例11：针对洗脱流动相的说明图12至图14分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为洗脱流动相中的水相的不同。图12为洗脱流动相中的水相为蒸馏水、有机相为甲醇溶液的色谱图，其中，图12中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5，图12中保留时间约为3.15min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为3.80min的色谱峰为内标物的色谱峰；图13为洗脱流动相中的水相为含有0.12％甲酸的水溶液、有机相为甲醇溶液的色谱图，图13中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2，图13中保留时间约为2.42min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为4.32min的色谱峰为内标物的色谱峰；图14为洗脱流动相中的水相为含有10mm乙酸铵的水溶液、有机相为甲醇溶液的色谱图，图14中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5，图14中保留时间约为3.08min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为5.60min的色谱峰为内标物的色谱峰。通过图2、图12至图14可见，当洗脱流动相的水相中不添加甲酸、不添加缓冲盐时，拉莫三嗪的紫外最大吸收波长发生偏移，使得拉莫三嗪的响应值增加，且内标物的保留行为因洗脱流动相中的ph值的改变而出现色谱峰展宽现象，影响待测样品的检测准确性；当洗脱流动相的水相中仅添加甲酸时，拉莫三嗪的紫外最大吸收波长发生偏移，导致响应值降低，影响待测样品的检测准确性；当洗脱流动相的水相中仅添加乙酸铵时，拉莫三嗪的峰型良好，但内标物的色谱峰拖尾严重。因此，洗脱流动相中的水相包括：含有乙酸铵和甲酸的水溶液。实施例12：针对洗脱流动相中水相与有机相的体积比的说明图15和图16分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为洗脱流动相中的水相与有机相的体积比不同。图15为主泵中洗脱流动相中水相与有机相的体积比为46％:54％时的色谱图，图15中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5，图15中保留时间约为2.75min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为4.25min的色谱峰为内标物的色谱峰；图16为主泵中洗脱流动相中水相与有机相的体积比为57％:43％时的色谱图，图16中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2，图16中保留时间约为4.50min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为10.25min的色谱峰为内标物的色谱峰。通过图2、图15和图16可见，在主泵采用等度洗脱进行检测时，水相在洗脱流动相中体积占比小于47％时，拉莫三嗪的色谱峰于杂质峰的分离度较差，易受杂质干扰，影响待测样品的检测准确性；而水相在洗脱流动相中体积占比大于56％时，内标物出峰时间较晚，导致内标物的保留时间增大，增大了待测样品的检测时间。实施例13：针对萃取剂的说明图17至图22对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为萃取剂的不同。图17是萃取剂为乙酸乙酯时的色谱图，图17中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5，图17中保留时间约为3.34min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为6.23min的色谱峰为内标物的色谱峰；图18是萃取剂为正己烷时的色谱图，图18中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2，图18中保留时间约为6.25min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰；图19是萃取剂为乙腈时的色谱图，图19中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2，图19中保留时间约为3.25min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为6.00min的色谱峰为内标物的色谱峰；图20是萃取剂为甲醇时的色谱图，图20中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2，图20中保留时间约为3.25min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为6.00min的色谱峰为内标物的色谱峰；图21是萃取剂为含有6％磺基水杨酸的水溶液时的色谱图，图21中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2，图21中保留时间约为3.30min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为6.12min的色谱峰为内标物的色谱峰；图22是萃取剂为含有0.5m硫酸锌的水溶液时的色谱图，图22中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2，图22中保留时间约为3.30min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为6.13min的色谱峰为内标物的色谱峰。通过图2、图17至图22可见，萃取剂为含有95％甲基叔丁基醚的乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯时，得到的待测样品的色谱峰均不是前沿峰、拖尾峰，并且色谱峰的峰宽没有出现过宽的情况。而当萃取剂为正己烷、乙腈、甲醇、含有6％磺基水杨酸的水溶液和含有0.5m硫酸锌的水溶液时，待测样品中目标物的萃取效率低，拉莫三嗪的响应信号较低，且待测样品的色谱峰中杂质峰较多，影响待测样品的检测准确性。实施例14：针对色谱柱的说明图23至图27对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，主要区别为色谱柱的不同。图23是色谱柱为waters-xbridgec18(填料粒径5μm，内径为4.6mm，长度为150mm)时的色谱图；其中，图23中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5，图23中保留时间约为3.65min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为5.25min的色谱峰为内标物的色谱峰；图24是色谱柱为thermoacclaimpolaradvantageⅱ(填料粒径5μm，内径为4.6mm，长度为150mm)时的色谱图；其中，图24中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5，图24中保留时间约为2.45min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为4.20min的色谱峰为内标物的色谱峰；图25是色谱柱为shimadzushim-packveloxc18(填料粒径2.7μm，内径为2.1mm，长度为100mm)时的色谱图；其中，图25中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为2.0，图25中保留时间约为0.90min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为1.36min的色谱峰为内标物的色谱峰；图26是色谱柱为agilentextend-c18(填料粒径3.5μm，内径为2.1mm，长度为100mm)时的色谱图；其中，图26中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为2.0，图26中保留时间约为1.0min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为1.5min的色谱峰为内标物的色谱峰；图27是色谱柱为phenomenexkinetexevoc18(填料粒径5μm，内径为2.1mm，长度为150mm)时的色谱图；其中，图27中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为2.0，图27中保留时间约为1.38min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为2.0min的色谱峰为内标物的色谱峰。通过图23至图27可见，色谱柱为waters-xbridgec18、thermoacclaimpolaradvantageⅱ、shimadzushim-packveloxc18、agilentextend-c18和phenomenexkinetexevoc18时，目标物的色谱峰保留较差，且目标物的色谱峰出现拖尾的情况，不符合检测要求，影响待测样品的检测准确性。实施例15：针对内标物的说明图28和图29对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为内标物的不同。图28是内标物为盐酸赛庚啶时的色谱图，图29是内标物为维拉帕米时的色谱图，其中，图28和图29中的横坐标的单位长度均为0.5，纵坐标的单位长度均为0.5，图28和图29中保留时间约为3.35min的色谱峰均为拉莫三嗪的色谱峰。通过图28和图29可见，内标物为盐酸赛庚啶时，无法检测到盐酸赛庚啶的色谱峰，当内标物为维拉帕米时，内标物的色谱峰峰形异常，因此均会影响待测样品的检测准确性。实施例16：针对波长的说明图30至图32对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为检测波长的不同。图30是检测波长为320nm时的色谱图，图30中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2，图30中保留时间约为3.30min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为6.10min的色谱峰为内标物的色谱峰；图31是检测波长为285nm时的色谱图，图31中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5，图31中保留时间约为3.30min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为6.1min的色谱峰为内标物的色谱峰；图32是检测波长为246nm时的色谱图，图32中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为1.0，图32中保留时间约为3.30min的色谱峰为拉莫三嗪的色谱峰，保留时间约为6.05min的色谱峰为内标物的色谱峰。通过图30至图32可见，当紫外检测器的检测波长仅选择320nm时，内标物的响应值较低，会影响对待检测样品的检测灵敏度；当紫外检测器的检测波长仅选择285nm时，拉莫三嗪、内标物和杂质的响应值均增强，而且杂质响应值的增强导致了拉莫三嗪出峰处的基线不平，从而影响待测样品的检测准确性；当紫外检测器的检测波长为246nm时，拉莫三嗪的响应值较高，但基线噪音波动较大，导致基线不平，且内标物的响应值较低，会影响对待检测样品的检测准确性。需要说明的是，图2、图3、图5、图6以及图10至图32的横坐标均为采集时间(min)，纵坐标均为信号强度(mau)，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。当前第1页12