专利名称:鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域：
的方法，具体是一种鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法。
背景技术：
禽流感，尤其是HPAI(高致病性禽流感)，对禽类养殖业具有很大的危害。目前有效控制禽流感的方法之一是疫苗接种，有效评价免疫效果的一个指标就是检测免疫后的抗体水平，因此有效区分自然感染产生的抗体与免疫接种产生的抗体非常重要。传统的血清学诊断禽流感的方法有HA-HI(血凝和血凝抑制试验)、AGP(琼脂免疫扩散)、微量中和以及NIF(神经氨酸酶抑制试验)，由于这些方法所检测的抗体，不管是接种疫苗还是感染野毒均会产生，因此这些检测方法不能真实反映禽流感的实际感染情况，给防控禽流感带来极大的困难。
经对现有技术的文献检索发现，王泽霖等在《中国科技》(2006年213卷14-17页)发表的题为“非结构蛋白NS1-酶联免疫吸附试验检测禽流感野毒感染抗体”论文，及杨涛等在《中国兽医科技》(2005年25卷585-589页)发表的题为“H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白的原核表达及其酶联免疫吸附试验检测方法的建立”的论文，都对利用禽流感非结构蛋白(NS1蛋白)作为包被抗原，通过酶联免疫吸附试验的方法，在个体水平上检测鸡血清中针对NS1蛋白的相关抗体IgG水平有相关报道。但是，一方面，NS1蛋白是一种弱抗原，不易激发机体产生高滴度的抗体。即是自然感染的鸡群在不同个体水平上可能不会产生很高的抗体滴度；另一方面，由于目前所用禽流感灭活疫苗均用鸡胚制作，鸡胚繁殖病毒的过程中，也有NS1蛋白的产生，应用鸡胚尿囊液制备的油乳剂灭活疫苗中就有NS1蛋白，因此免疫鸡群特别是多次免疫的鸡群中很可能存在一定量的针对NS1蛋白的抗体，也就是说在个体水平上，自然感染禽流感病毒的鸡的NS1抗体水平可能不高，或者是免疫接种鸡的NS1抗体水平可能比较高，所以，从个体水平上鉴别诊断禽流感的感染情况往往有很大的偏差。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种群体水平鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，使其利用群体水平上禽流感NS1蛋白抗体在自然感染鸡群与免疫接种鸡群含量的不同，通过酶联免疫吸附试验的方法检测鸡血清中与NS1抗原反应的抗体IgG水平，通过确定禽流感血清酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值和最少实验动物数，从群体水平鉴别诊断鸡群禽流感的野毒感染。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明具体步骤包括①通过反转录聚合酶链式反应扩增H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的基因；②将步骤①扩增所得H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的基因通过酶切插入到载体质粒pET-32a(+)中，构建出原核表达质粒，将构建好的质粒转入大肠杆菌BL21中，IPTG(异丙基巯基半乳糖苷)诱导表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹实验鉴定为分子量44.2KD的融合蛋白；③将步骤②所得融合蛋白作为抗原包被酶标反应板，建立酶联免疫吸附试验的方法，确定最佳反应条件，包括抗原的最佳包被浓度、抗体的最佳稀释倍数、抗原抗体最佳反应时间、酶标二抗的最佳稀释倍数和酶标二抗的最佳反应时间；④按照步骤③建立的酶联免疫吸附试验的方法，对禽流感H9N2感染组鸡血清、30日龄非免疫鸡的阴性血清、禽流感H9N2灭活疫苗接种组鸡血清进行检测；⑤按照统计学方法对检测结果进行分析，确定禽流感血清的酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值和最少样本数；⑥根据血清样本酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值和规定的最少检测样本数，按照鸡群血清样本的酶联免疫吸附试验平均吸光度的大小，平均吸光度高于临界值的确定为鸡群感染了禽流感野毒。
所述的禽流感血清酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值，是对70份禽流感H9N2感染组鸡血清、30份30日龄非免疫鸡的阴性血清、95份禽流感H9N2灭活疫苗接种组鸡血清进行统计学分析后，取30日龄非免疫鸡的阴性血清的平均值加三个标准差作为禽流感血清阴阳性判定的临界值。
所述的禽流感血清酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值是0.5。
所述的最少样本数，是通过统计学分析，规定酶联免疫吸附试验确定鸡群整体是否感染禽流感病毒的所需要的最少的鸡的个数。最少样本数是30。
所述的最佳反应条件为抗原的最佳包被浓度为40μg/mL、抗体的最佳稀释倍数为1∶200、抗原抗体最佳反应时间是1h、酶标二抗的最佳稀释倍数是1∶10000和酶标二抗的最佳反应时间是1h。
所述的抗原，是经大肠杆菌原核表达的H9N2型禽流感病毒NS1蛋白，包被在固相载体上进行抗体的测定，对待测血清样品进行定性分析。
酶联免疫吸附试验利用酶标记的抗原或抗体，在固相载体上进行的抗原或抗体的测定。酶联免疫吸附试验的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈现的颜色的深浅进行定性或定量分析。本发明是以禽流感病毒NS1蛋白作为抗原包被酶标反应板，将待测血清样品按照一定比例稀释与抗原反应，加入酶标二抗，最后加底物显色，根据测定显色样品的OD值来判定结果。
所述H9N2型禽流感病毒，是指甲型流感病毒血凝素(H)及神经氨酸酶(N)分为15个H型和9个N型。本发明所用的是H9N2型禽流感病毒。
本发明是鉴于NS1蛋白在自然感染鸡群体内和疫苗免疫鸡群体内产生抗体的不同，通过酶联免疫吸附试验计算鸡群血清的平均OD值来鉴别诊断的。用原核表达的NS1蛋白作为抗原包被酶标反应板，将待检血清通过一定稀释与包被的抗原反应，再加入抗IgG的酶标二抗显色，通过测定鸡群平均OD值的大小来判定鸡群是否感染了禽流感。
本发明方法通过计算鸡群总体NS1抗体水平，可以鉴别禽流感自然感染的鸡群与灭活疫苗免疫鸡群，而传统的血清学诊断禽流感的方法有血凝和血凝抑制试验、琼脂免疫扩散、微量中和以及神经氨酸酶抑制试验，由于这些方法所检测的抗体，不管是接种疫苗还是感染野毒均会产生，因此这些检测方法不能真实反映禽流感的实际感染情况，给防控禽流感带来极大的困难。本发明方法从总体鉴别诊断，忽略了个体差异，通过计算血清平均OD值的方法，从群体水平来鉴别诊断整个鸡群是否感染了禽流感病毒。在95份疫苗接种组血清中，OD450＞0.5的样品数量占33.6％，但是这些鸡并没有感染禽流感病毒，而是疫苗效价高才导致如此。如果从个体水平检测，这些鸡会被判定为阳性；70份禽流感H9N2阳性血清中，OD450＞0.5的样品数量占74.3％，剩余的25.7％的鸡从个体水平检测会被判定为阴性，而利用本发明的方法可以鉴别鸡群的整体是否感染了禽流感病毒，为诊断、预防禽流感提供依据。
具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等在《分子克隆实验室手册》(纽约冷泉港实验室出版社，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本实施例首先将H9N2型禽流感病毒进行反转录聚合酶链式反应扩增，获得目的片断，再将目的片断与载体pET-32a(+)质粒连接，得到重组表达质粒，并导入大肠杆菌BL21表达，获得一个分子量为44.2KD的融合蛋白，该融合蛋白经过纯化，得到纯度较高的H9N2型禽流感病毒NS1蛋白；将该NS1蛋白作为抗原包被酶标反应板，确定酶联免疫吸附试验的最佳反应条件(具体包括抗原的最佳包被浓度，抗体的最佳稀释倍数，抗原抗体最佳反应时间，酶标二抗的最佳稀释倍数和酶标二抗的最佳反应时间)；按上述最佳反应条件建立酶联免疫吸附试验的方法，测定70份禽流感H9N2感染血清、95份灭活疫苗接种血清、30份非免疫鸡的阴性血清的酶联免疫吸附试验平均吸光度，通过统计学分析确定血清样本酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值、最少样本数；最后根据鸡群样本的酶联免疫吸附试验平均吸光度，从群体水平鉴别诊断鸡群是否被禽流感病毒感染。
H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的原核表达H9N2型禽流感NS1基因的克隆用Trizol试剂(Invitrogen公司)抽提总RNA。根据禽流感NS1基因保守序列设计引物进行反转录聚合酶链式反应扩增，扩增后连接到pMD-18 T载体(Takara公司)上测序，根据测序结果设计上游包含EcoR I限制性酶切位点和下游包含Xho I限制性酶切位点的引物，进行聚合酶链式反应扩增。
NS1蛋白表达载体的构建以EcoR I和Xho I分别酶切上述聚合酶链式反应产物和pET-32a(+)，T4 DNA连接酶(Takara公司)10-16℃过夜连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，提取质粒，用EcoR I和Xho I酶切鉴定，将鉴定呈阳性的重组质粒测序，结果显示所扩增序列与禽流感病毒香港株(A/aquatic bird/HongKong/399/99)的NS1蛋白同源性达到98％，所以经过反转录聚合酶链式反应后，所扩增的序列是禽流感NS1蛋白。
NS1蛋白的表达将经鉴定过的阳性重组质粒，转入大肠杆菌BL21中，挑取1个菌落接种2ml氨苄青霉素LB培养基过夜培养，取200μl过夜培养菌液接种20ml氨苄青霉素LB培养基，37℃150转/分摇菌2h，至OD600为0.4-1，加异丙基巯基半乳糖苷至终浓度为1mM，25℃摇菌4h后，收取菌液。
NS1蛋白的检测(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳配制14％的分离胶和5％的浓缩胶。样品用上样缓冲液沸水煮4min，浓缩胶电压80V，分离胶电压136V，电泳4-5h，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用考马斯亮兰对聚丙烯酰胺凝胶染色2h，以脱色液脱色，观察凝胶上的蛋白条带，在44KD处有明显的条带出现，(2)蛋白质免疫印迹实验鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳结束时，保留上述聚丙烯酰胺凝胶，用蒸馏水淋洗石墨板，保持石墨板的清洁，然后用纸揩干，切6张滤纸和一张硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜浸没于去离子水的水面上，滤纸浸没于转移缓冲液中，平衡5min，然后将滤纸、硝酸纤维素膜和聚丙烯酰胺凝胶按滤纸(三张)、硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶、滤纸(三张)的顺序从阳极到阴极摆放正确，按照0.65mA/cm2通电转印5h，将硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和禽流感阳性血清(禽流感阳性血清为1∶100稀释)，4℃过夜孵育，再转入37℃孵育2h，反应后，取出硝酸纤维素膜先用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗三次，每次10min，再用杂交膜清洗液(TBST)漂洗10min，然后将硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和1∶1000稀释的免抗鸡IgG二抗(Bethyl laboratories.Inc)，37℃孵育2h，反应结束后，将硝酸纤维素膜放杂交膜清洗液中漂洗3次，每次1h，然后加入底物显色2-3min，结果发现硝酸纤维素膜上在44KD处有黑色条带出现。
酶联免疫吸附试验方法的建立利用纯化的重组禽流感NS1蛋白作为抗原建立酶联免疫吸附试验，测定抗原的最佳包被浓度、抗体的最佳稀释浓度，抗原抗体最佳反应时间，酶标二抗的最佳稀释倍数，酶标二抗的最佳反应时间。抗原按40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL浓度稀释，包被反应板100μL/孔，4℃过夜，然后用酶联免疫吸附试验洗液洗涤5次，再用5％的脱脂乳封闭液37℃封闭2小时；禽流感病毒感染血清、灭活疫苗接种血清及阴性血清分别用抗体稀释液稀释50、100、200、400倍，与上述抗原的不同稀释度组成方阵100μL/孔，按常规方法建立检测NS1抗体的酶联免疫吸附试验，将相同稀释度作一个重复，在酶标仪上读出OD450，比较三种血清的OD450值，选择阴性血清OD值为0.3以下以及病毒感染与疫苗接种组血清OD值比值较高的包被抗原的最大稀释度为抗原包被的最佳浓度，相应的血清的最大稀释度为最佳血清稀释度，从而确定了抗原的最佳包被浓度和抗体的最适稀释倍数。抗原的最佳包被浓度为40μg/mL，抗体的最佳稀释倍数为1∶200。
重组抗原和H9N2型禽流感标准阳性血清最佳倍数稀释反应1h后，将HRP标记的免抗鸡IgG抗体按1∶500、1∶1000、1∶10000、1∶100000稀释，反应1h，再加入底物液显色测定OD450，当出现OD450最大的二抗浓度即为最佳稀释浓度。酶标二抗的最佳稀释倍数是1∶10000。
重组抗原和H9N2型禽流感标准阳性血清、阴性血清各6份按最佳倍数稀释后，分别反应0.5h、1h、1.5h，加入酶标二抗，显色，测定OD450，当阳性和阴性血清比值最大时的反应时间即为最佳反应时间。抗原抗体最佳反应时间是1h。
抗原和4份H9N2型禽流感标准阳性血清、阴性血清按最佳倍数稀释后，反应一定时间，加入酶标二抗，分别反应0.5h、1h、1.5h，显色测定OD450，当阳性和阴性血清比值最大时的反应时间即为酶标二抗的最佳反应时间。酶标二抗最佳反应时间是1h。
酶联免疫吸附试验阴阳性临界值和最少样本数的制定通过测定70份禽流感H9N2感染血清、95份灭活疫苗接种血清、30份非免疫鸡的阴性血清的OD值，疫苗接种组血清酶联免疫吸附试验OD450值的平均值X＝0.428，标准差SD＝0.228。禽流感H9N2感染血清组酶联免疫吸附试验OD450值的平均值X＝0.576，标准差SD＝0.151。参照文献(《兽医流行病学原理》，刘秀梵主编，农业出版社)，对二者进行t检验，t＝5.016。t＞t83，0.05(双侧)(83为t检验的自由度)，差异显著。即通过酶联免疫吸附试验可以在群体水平将灭活疫苗接种组血清和禽流感H9N2感染组血清区别。
本实施例采用的判定标准是阴性样本的平均值加三个标准差，非免疫鸡阴性血清组的平均值为X＝0.222，标准差SD＝0.09221。判定阴阳性结果的OD450临界值为X+3SD＝0.5，如果群体血清的OD450平均值高于0.5，则判定为阳性；如果低于0.5，判定为阴性。
本实施例是从整体水平检测鸡群是否感染禽流感病毒。通过检验鸡群平均OD450来判定鸡群全体是否感染禽流感病毒。参考文献(《兽医流行病学原理》，刘秀梵主编，农业出版社，147-148页)中实验样本数的规定2.58=p-qp(1-p)-q(1-q)n]]>p为病毒感染组样品中OD450＞0.5的样本数量所占的百分数；q为疫苗免疫组样品中OD450＞0.5的样本数量所占的百分数；n为所需的实验动物数。
95份疫苗接种组血清中，OD450＞0.5的样品数量占33.6％；70份禽流感H9N2阳性血清中，OD450＞0.5的样品数量占74.3％。按照以上公式，得到实验血清样本数为30份。所以，在进行群体检测时，所检测的实验血清样本数至少为30，才可以有效鉴别鸡群是否感染禽流感病毒。
酶联免疫吸附试验鉴别诊断禽流感病毒自然感染鸡群将纯化的NS1蛋白用包被稀释液稀释到40μg/ml后，每孔加入100μl，4℃过夜，37℃2h后，弃去孔内液体，再选择5％脱脂乳37℃封闭2h，然后弃去孔内液体，洗涤缓冲液(PBST)清洗5遍；将待测血清样本1∶200倍稀释，每孔加入100μl，37℃1h，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液清洗清洗5遍，其后加入酶标抗IgG抗体100μl，37℃1h，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗液清洗5遍。再加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMD)100μl室温显色8min，其后加入50μl终止液终止反应，测定OD450。判定结果。当所检测的鸡的数量大于30时，所检测鸡血清平均OD450大于0.5时，判定鸡群感染了禽流感，当所检测鸡血清平均OD450小于0.5时，判定鸡群未感染禽流感。
权利要求
1.一种鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征在于，所述方法具体步骤包括①通过反转录聚合酶链式反应扩增H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的基因；②将步骤①扩增所得H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的基因通过酶切插入到载体质粒pET-32a(+)中，构建出原核表达质粒，将构建好的质粒转入大肠杆菌BL21中，异丙基巯基半乳糖苷诱导表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹实验鉴定为融合蛋白；③将步骤②所得融合蛋白作为抗原包被酶标反应板，建立酶联免疫吸附试验的方法，确定反应条件；④按照步骤③建立的酶联免疫吸附试验的方法，对禽流感H9N2感染组鸡血清、30日龄非免疫鸡的阴性血清、禽流感H9N2灭活疫苗接种组鸡血清进行检测；⑤按照统计学方法对检测结果进行分析，确定禽流感血清的酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值和最少样本数；⑥根据血清样本酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值和规定的最少检测样本数，按照鸡群血清样本的酶联免疫吸附试验平均吸光度的大小，平均吸光度高于临界值的确定为鸡群感染了禽流感野毒。
2.根据权利要求
1所述的鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征是，步骤②中所述的融合蛋白，其分子量为44.2KD。
3.根据权利要求
1所述的鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征是，步骤③中所述的酶联免疫吸附试验，其反应条件为抗原的包被浓度为40μg/mL，抗体的稀释倍数为1∶200，抗原抗体反应时间是1h，酶标二抗的稀释倍数是1∶10000，酶标二抗的反应时间是1h。
4.根据权利要求
1所述的鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征是，步骤④中所述的禽流感血清酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值，是由对70份禽流感H9N2感染组鸡血清、30份30日龄非免疫鸡的阴性血清、95份禽流感H9N2灭活疫苗接种组鸡血清进行统计学分析后，取30日龄非免疫鸡的阴性血清的平均值加三个标准差而得。
5.根据权利要求
4所述的鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征是，步骤④中所述的禽流感血清酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值是0.5。
6.根据权利要求
1所述的鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征是，步骤④中所述的最少检测样本数是通过统计学分析，规定酶联免疫吸附试验确定鸡群整体是否感染禽流感病毒的所需要的最少的鸡的个数。
7.根据权利要求
6所述的鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征是，步骤④中所述的最少检测样本数是30。
8.根据权利要求
1所述的鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征是，步骤⑤中所述的按照鸡群血清样本的酶联免疫吸附试验平均吸光度的大小，确定鸡群是否感染禽流感野毒，是指鸡群血清样本的酶联免疫吸附试验平均吸光度大于0.5，鸡群感染禽流感病毒；鸡群血清样本的酶联免疫吸附试验平均吸光度小于0.5，鸡群没有感染禽流感野毒。
专利摘要
一种鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，属于生物工程技术领域：
。本发明首先将H9N2型禽流感病毒进行扩增，获得目的片断，将该片断与载体连接，得到重组表达质粒，导入大肠杆菌表达，获得一个融合蛋白；该融合蛋白经过纯化，得到H9N2型禽流感病毒NS1蛋白，将该蛋白作为抗原包被酶标反应板，建立酶联免疫吸附试验方法测定待检血清中与抗原反应的抗体水平，通过统计学分析确定酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值、最少的检测样本数；最后根据鸡群样本的酶联免疫吸附试验平均OD值大小，从群体水平鉴别诊断鸡群是否被禽流感野毒感染。本发明方法从总体鉴别诊断，降低了非特异性反应，为及时诊断、预防禽流感提供科学依据。
文档编号G01N33/543GK1996021SQ200610148212
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月28日
发明者孙建和, 王琰, 陆承平, 严亚贤 申请人:上海交通大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan