专利名称：一种检测抗体抗原的膜片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测抗体抗原的膜片及其制备方法，也涉及该膜片的用途。例如，利用此膜片进行的一种快速、简便体液中丙型肝炎病毒抗体的检测。
丙型肝炎是一种由非甲非乙型肝炎病毒引起的病毒性肝炎，主要通过被感染的血液传染，感染后一半以上转为慢性，其中又有20%左右发展为肝硬化和肝细胞癌，所以丙型肝炎的传播已在世界范围内引起极大的重视。
由于丙型肝炎病毒感染的患者血清中病毒抗原浓度很低，只有乙型肝炎病毒的1/105，用常规的免疫方法很难进行检测。
1989年，美国学者Choo等(Choo，Q-L et al∶Science，244∶359～362，1989)应用分子克隆技术，获得了特异性丙型肝炎病毒(HCV)抗原，使对丙型肝炎的研究和检测有了迅速发展。目前常用的诊断方法主要有三种(汪涛等国外医学，临床生物化学检验学分册142-5，1993)。
第一种为酶联免疫吸附法(ELISA)检测HCV抗体，这是目前应用最为广泛的一种方法，世界各国利用这种方法出了许多试剂盒，我国也已开始生产，它为丙型肝炎的普查，献血员的筛选等作出了积极性贡献，但也日益暴露出一些问题，较突出的是准确性问题。包括严重的假阳性(Vander poel C.L et al∶Lancet 337∶317-319，1991;Serfaty.L et al∶Hepatology 17∶183-187，1993)，不少研究者认为此方法所用固定相塑料孔板本身的非特异性吸附造成这种方法特异型差的一个重要原因(Gray JJ et al∶Lancet 335609～610 1990;Goese T et al∶Lancet 336∶878，1990)。
第二种为多聚酶链反应(PCR)法检测HCV RNA此法有许多明显的优点特异性强、灵敏度高，可用于HCV感染的早期诊断等，但用PCR法检测1个样品需要几天到一周，费时、费力、费材、不可能普及，另外如操作不当，也容易发生污染而出现假阳性。
第三种为重组免疫印迹试验(RIBA)分析HCV抗体，此为蛋白质的凝胶电泳和另一种固相载体膜如硝酸纤维素免疫测定相结合发展起来的新方法，特异性强、灵敏度高，能测出HCV不同成分多肽的相应抗体应答状况。美国Chicon公司已研制出RIBA试剂盒，并认为是HCV的确诊试验。这种方法与PCR及临床都有最好的一致性(Chemello，L et al∶Hepatology 17∶179～182，1993;Romeo，J M et al∶Hepatology 17∶188～194，1993)，但此方法涉及的检测实验也非常复杂，且价格相当昂贵，要推广并作为丙型肝炎的筛选试验也不太可能。
本发明结合了ELISA法和RIBA法的优点，并用特定办法制得膜片，将混合的多抗系以特殊形状点直接固定在载体如硝酸纤维素膜上，并用一系列相应措施进行检测，使方法特异性好、灵敏度高、简便、快速，并使结果易于判断。
本发明是通过以下实施方案实现的一、一种检测抗体原膜片的制备将市售的载体膜(如硝酸纤维素膜。尼龙衬底膜即ZB膜等)裁成所需大小，画定或用事先打好孔的胶纸固定(即下层是载体膜。上层是打好的孔，如d＝3～5mm)有一定孔距(如1～4mm)的胶纸，胶面与载体膜粘紧露出膜孔，将待测抗体(或抗原)的相应抗原(或抗体)用碱性缓液(PH8～10)配制，用微量点样器(如微量注射器)以每个0.4～2μl点在膜孔上，把胶膜放于50℃～70℃烘箱半小时，再将整块胶膜用非特异性蛋白水溶液(如3%脱脂奶粉水溶液)封闭待用。制备好的每张膜片可由数个到数十个膜孔组成为宜。用此膜片剪下二孔可进行标准阴阳膜条的制备。
二、标准阴阳膜条的制备制备方法如下
1.将含有抗体(或抗原)和不含抗体(或抗原)的体液4～5μl分别点在上述制备好的膜片的二个膜孔里，然后将此含二膜孔的膜片条置37℃～42℃温箱烘干。
2.因用硝酸纤维素膜作固相，灵敏度稍低，须依靠下列措施提高灵敏度①用具有1015结合常数的生物素一亲和素系统即检测系统依靠生物素标记的抗人IgG，并用亲和素标记的酶结合物去结合。
并采用高浓度接触系统(措施见实施方案二、3)②底物采用二氨基联苯胺，并加0.01%～0.05%H2O2和0.01～0.10%的钴盐或镍盐(如氯化钴、硫酸钴、氯化镍、硫酸镍等)增敏。
3.使反应快速、并降低成本的一项有力措施是生物素标记的抗人IgG和抗体原复合物的反应及亲和素标记的酶结合物和生物素反应均采用高浓度溶液和膜直接接触法。具体做法是在一块比膜片稍大的具有极好表面张力的塑胶片上滴加高浓度的上述溶液(成滴状而不扩散)将胶膜孔向下直接置于液滴上，使液滴与所有膜孔紧密接触，并再置37℃～42℃温箱孵育。
4.结果判断明了简便如附图
所示，图为制备好的标准阴阳膜条示意图用底物显色后，在含抗体液膜孔内有紫红色显色点(图中3)，此为阳性体液(+)，在不含抗体体液膜孔内无紫红色点，此为阴性体液(-)。图中1为载体膜，2为打好的孔粘在载体膜上的胶纸。凡待测样品孔均可与此备好的标准阴阳膜条对照以判断阴阳性，不必每次进行含标准阴阳抗体(或抗原)体液的检测。
本发明的膜片配以标准阴阳膜条及上述检测试剂进行体液中含量很微的抗体抗原系列疾病的检测。可制成各类试剂盒，如甲肝试剂盒，乙肝、丙肝、丁肝、早早孕等试剂盒，以供临床诊断和研究之用。
以下以在血清中含量极微的丙型肝炎病毒抗体的测试为例，说明此膜片和本测试方法的应用。
1.丙型肝炎病毒抗原的制备目前该病毒通常使用的方案均可采用。可用几个结构区抗原多肽和非结构区抗原多肽的混和物，也可用基因表达产物或抗原多肽及基因表达抗原产物的混合物。将选用的抗原溶解在或对PH8～10的缓冲液透析、待用。
2.将上述抗原溶液以每孔0.4～2μl点在膜片的各膜孔内，膜片的制备均如上述实施方案一。
3.将检测血清直接点在膜孔内，每孔1人份，然后置37℃～42℃温箱干燥。
4.用含0.5%Tween 20的0.1MPBS(PH7.4)洗涤液浸洗膜片，约3分钟，去尽血污，再冲洗一遍后，置滤纸上吸干洗涤液。
5.按上述实施方案二中的的3，将膜片置于先滴加了市售或自制的生物素化羊抗人IgG(2.5ml/40孔)的塑胶片上，并置40°温箱15分钟。从温箱取出，用洗涤液冲洗后，再将胶膜置于先滴加市售或自制亲和素化辣根过氧化物酶结合物(2.5ml/40孔)的塑胶片上，置40℃温箱孵育8分钟。
6.取出用洗涤液冲洗后，按实施方案二，2.②底物显色系统显色，约3分钟后取出。
7.与标准阴阳膜条比较，膜孔中有紫红色显色点者为丙型肝炎病毒抗体阳性，无显色点者为阴性。
权利要求
1.一种检测抗体抗原的膜片，其特征在于膜片上由画定的孔或用事先打好孔的胶纸固定(即下层是载体膜，上层是打好孔，有一定孔距的胶纸，胶距与载体膜粘紧)露出膜孔，膜片的制备特征是将待测抗体(或抗原)的相对应抗原(或抗体)用碱性缓冲液(PH8～10)配制，用微样点样容器点在膜孔上，把胶膜放于50℃～70℃烘箱半小时，再将整块胶膜用非特异性蛋白水溶液封闭。
2.根据权利要求1的膜片，其是标准阴阳膜条，其特征在于阳性膜孔内有显色点。
3.权利要求1的膜片，可以用于体液中含量很微的甲型、乙型、丙型、丁型、戍型肝炎、早早孕及系列抗体抗原疾病的快速、简便检测。
4.一种用权利要求1的膜片进行快速简便体液中丙型肝炎病毒抗体的检测方法，其特征在于①直接将需检测血清依次点在制备好的膜片的各膜孔内，然后置37℃～42℃温箱干燥;②检测时采用高浓度溶液和膜直接接触法，即取一块比膜片稍大的具极好表面张力的塑胶片，滴加高浓度检测溶液(成滴状而不扩散)将膜片膜孔向下直接置于液滴中，使液滴与所有膜孔紧密接触，再置37℃～42℃温箱孵育;③底物采用二氨基联苯胺，并加0.01～0.05%H2O2和0.01～0.1%钴盐或镍盐增敏。
全文摘要
本发明涉及一种检测抗体或抗原的膜片及制备方法和利用该膜片进行快速简便检测体液中抗体或抗原的免疫学方法，并用此法进行血清中丙型肝炎抗体的检测。
文档编号G01N33/576GK1099868SQ9311664
公开日1995年3月8日 申请日期1993年9月1日 优先权日1993年9月1日
发明者魏群 申请人:魏群