P核磁共振的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及31P核磁共振对环境样品中磷组分含量的测定，尤其涉及一种利用亚 甲基二膦酸外标法定量液态31P核磁共振的方法。
【背景技术】
[0002] 磷（P)是土壤中的大量元素之一，是生物生长发育所必需的一种营养元素，也是 可能造成水体（湖泊、水库、河流等）富营养化的限制性元素。地壳中磷的平均含量为I. 2g kg'其中的95%存在于磷灰石矿物中。深入了解各种环境样品中磷组分的含量对明确磷 素的生物地球化学循环具有重要的意义。根据浸提剂对磷素的不同提取能力，传统化学分 级方法可以将磷素分为不同活性的无机磷与有机磷，如活性磷（容易被植物吸收利用）、中 活性磷（较易被植物吸收利用）、中稳磷（较难被植物吸收利用）以及蓄闭态磷（无法被植 物吸收利用）；但是传统化学分级提取步骤繁琐且对于磷素的具体成分依然不够明确。近 年来 31P核磁共振（31P NMR)技术作为分析环境样品中不同磷素组分的有效手段，是一种可 定性或定量磷素形态的先进波谱技术，得到了很快发展，在化学、生物、食品、农业等领域得 到了较广泛的应用。目前 31P NMR技术主要分为液态核磁和固态核磁两种方法，根据磷化合 物的不同化学位移可以确定磷素的具体种类信息；液态31P NMR技术在分析样品中有机磷 的形态时，具有明显的应用优势。与化学提取分级法、高效液相色谱法（HPLC)等方法相比， 液态 31P NMR技术对样品前处理步骤较少，能一次性获取多个磷化合物或者有机官能团的 信息。液态31P NMR定性检测环境样品中的磷化合物可以分为无机磷和有机磷两大类。无 机磷主要包括正磷酸盐、焦磷酸盐和多聚磷酸盐等，有机磷主要包括膦酸酯、正磷酸单酯、 正磷酸二酯等。然而，仍然有一部分学者认为液态NMR试验受到扫描次数、弛豫时间、溶液 性质等条件的影响，只能定性或半定量待测化合物，定量分析仍然存在较大偏差。这主要是 因为在定量过程中其它物质和杂质干扰较多，分离杂质的步骤复杂而且可能造成待测物的 损失。利用外标法则能较好地解决这个问题。对于液态核磁共振外标分析法，外标准物封 存在毛细管中，不易受共存离子的干扰，避免了与待测物质之间发生化学反应，不与特征峰 化学位移重叠，能够显著提高核磁共振定量分析的灵敏度、精确度、准确度及分析速度。Eva Lo ' Pez-Rituerto等在2009年应用1H NMR定量分析法，采用标准物质的外标法，研宄了葡 萄酒发酵过程中的酒精和苹果乳酸含量的变化，对乙醇、乙酸等实现了准确定量，较好地研 宄了葡萄酒的发酵过程。然而不同于H谱的是，利用 31P NMR在对环境样品中磷组分进行测 定时弛豫时间更长，影响31P NMR谱图上峰面积的因素很多，化学位移偏差较大，试验中外标 准物的选取对试验结果的影响很大
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种利用亚甲基二膦酸外标法定量液态31P核磁共振的方 法，能够利用套管体系避免共存离子之间的干扰，根据峰面积比例关系准确计算出各个磷 组分的含量，操作方法简便，适用于推广和应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0005] 利用亚甲基二膦酸外标法定量液态31P核磁共振的方法包括以下步骤：
[0006] (1)首先将含有亚甲基二膦酸水溶液的玻璃点样毛细管装入含有准确浓度磷酸二 氢钾重水溶液的标准核磁管，组成共轴套管体系；根据 31P NMR图谱上亚甲基二膦酸出峰的 积分面积（As)、磷酸二氢钾出峰的积分面积（Ax)及磷酸二氢钾浓度（C x)计算套管体系校正 系数a，校正系数的计算公式为：
【主权项】
1. 一种利用亚甲基二膦酸外标法定量液态31P核磁共振的方法，其特征是包括以下步 骤： (1) 首先将含有亚甲基二膦酸水溶液的玻璃点样毛细管装入含有准确浓度磷酸二氢钾 重水溶液的标准核磁管，组成共轴套管体系；根据 31P NMR图谱上亚甲基二膦酸出峰的积分 面积（As)、磷酸二氢钾出峰的积分面积（Ax)及磷酸二氢钾浓度（C x)计算套管体系校正系数 a，校正系数的计算公式为：a= f ; (2) 试验时用碱性提取剂溶解待测环境样品，在15~20°C避光条件下持续振荡16~ 20小时，而后在1500*g下离心20分钟得到浸提液，将浸提液在-20°C下预冻25-30分钟， 再用冷冻干燥机抽真空冷冻干燥12~24小时至粉末状，将所得粉末称重后溶解于重溶液 中； (3) 粉末重溶解后连同步骤（1)中所述同一玻璃点样毛细管转移至核磁管中，于 600MHz的核磁共振仪上进行31P NMR分析测定；根据31P NMR谱图上MDP出峰的积分面积 (As)与待测样品中磷化合物出峰的积分面积（Ax，）逐一计算不同磷组分的浓度（C X，），CX，的 计算公式为：CX'=
2. 根据权利要求1所述利用亚甲基二膦酸外标法定量液态31P核磁共振的方法，其特征 是：所述外标采用平直均匀的玻璃点样毛细管，长100mm，内径0· 5mm ;其一端用火焰烧结， 再将亚甲基二膦酸水溶液用注射器注于毛细管中，加至液面距毛细管上端Icm处，用火焰 烧结进行永久密封供后续定量试验使用。
3. 根据权利要求1所述利用亚甲基二膦酸外标法定量液态31P核磁共振的方法，其特 征是：所述亚甲基二膦酸水溶液是将亚甲基二膦酸晶体溶于去离子水中配制而成，其浓度 为 10 ~20mmol L 1O
4. 根据权利要求1所述利用亚甲基二膦酸外标法定量液态31P核磁共振的方法，其特 征是：所述磷酸二氢钾重水溶液的准确浓度为IOmmol LS所述碱性提取剂为浓度0. 25mol Γ1的NaOH溶液和0. 05mol厂1Na2EDTA溶液混合液。
5. 根据权利要求1所述利用亚甲基二膦酸外标法定量液态31P核磁共振的方法，其特 征是：所述重溶液是由IOmol T1NaOHj 05mol T1Na2EDTA和D2O组成的混合液。
【专利摘要】本发明涉及利用亚甲基二膦酸（MDP）作外标定量环境样品的液态31P核磁共振（NMR）的方法。试验前将封装了MDP水溶液的玻璃毛细管与装有确定浓度磷酸二氢钾溶液的核磁管组成共轴套管体系，计算套管体系校正系数。试验时用碱性提取剂溶解样品，持续振荡后离心得到浸提液，将浸提液冷冻干燥；所得粉末溶解于重溶液中，重溶解后连同玻璃毛细管转移至核磁管中，根据31P NMR谱图上MDP与待测磷化合物的峰面积比计算各磷组分的浓度。利用含MDP溶液的毛细管作为液态31P NMR的外标测定环境样品中的磷浓度，不易受共存离子的干扰，不与特征峰化学位移重叠，并且免去了用等离子体光谱仪法或化学法等测定重溶解液中总磷的步骤，适于多种环境样品中磷组分的测定分析。
【IPC分类】G01N1-40, G01N24-08
【公开号】CN104634806
【申请号】CN201510052943
【发明人】金熠, 梁新强, 刘于, 傅朝栋, 李亮, 叶玉适
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月2日