针对赋予膦丝菌素-n-乙酰转移酶抗性的酶的单克隆抗体及检测方法
【专利说明】针对赋予麟竺菌素-N-乙醜转移酶抗性的酶的单克隆抗体 及检测方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求获得于2012年10月10日提交的美国专利申请系列号61/711，950的 权益。
技术领域
[0003] 本发明设及的领域是应用于旨在检测由某些转基因植物事件表达的酶的 ELISA(酶联免疫吸附测定法）的免疫学，该些酶可赋予对草锭麟，即k麟丝菌素除草剂的 抗性。
[0004] 背景
[0005] 编码麟丝菌素-N-己酷转移酶（PAT)巧0 2.3. 1. 183)的基因常规地用作植物 转基因事件的可选择标记，它们最初是从常见的好氧上壤放线菌一一绿色产色链霉菌 (Streptomycesviridoc虹omogenes)中分离的。PAT酶催化麟丝菌素的己酷化，将其脱毒 为无活性的化合物，导致氨积累和细胞死亡（MurakamiT.，AnzaiH.，ImaiS.，SatohA.， P'JagaokaK.，ThompsonC.J. (1986).MolGenGenet205:42-50;TwellD.，KleinT.M.， 化ommM.E.，McCormickS. (1989).Plant化ysiol91 ; 1270-1274.)。因此，表达PAT的转化 植物细胞能够用草锭麟加W选择。
[0006] 开发并销售用于播种用种子产品（plantingseedpro化cts)的重组DNA性状 (traits)的公司制订、执行并遵守严格的产品管理计划。该些管理计划要求对重组性状的 各种组分使用经验证的定量和定性蛋白质检测方法，W跟踪性状渗入和种子产生活性，W 及监测谷物收成。该些检测方法必须足够容易使用并且足够鲁椿，W供在GLP和非GLP条 件下使用。此外，该些方法必须对用户足够友好，W使农民便于在田间、粮商便于在筒仓、海 关官员便于在边境使用。因此，鲁椿、高质量、用户友好的蛋白质检测方法和商业试剂盒是 有用的且必要的。
[0007] 尽管化ISA在本领域众所周知，但是开发能够在实验室和田间设置下重复检测一 系列植物组织中的特定转基因产物的鲁椿、高质量、经验证的（validatecOELISA方法既不 是琐碎小事，亦非常规手段。更具有挑战性的是发现特别适合于开发用于检测功能性PAT 转基因事件的侧向流试纸条（lateralflowstrip)和/或化ISA的抗体对（antibody pairs)。 发明概要
[0008] 本发明提供了一组单克隆抗体（mAbs)，155AD4，15祀2. 1. 114，15593，155912，和 155Q19. 1，和产生该些mAbs的杂交瘤细胞系。该些mAbs令人惊讶地非常适用于检测多种 植物和植物组织中表达PAT的转基因事件。本发明进一步提供了使用本发明免疫球蛋白的 定量和定性免疫测定法，并且一般性地包括用于鉴定PAT酶存在的方法，其包括a)将第一 种要求保护的mAb固定在测定表面上，然后清洗所述测定表面；b)使所述测定表面与怀疑 含有PAT的液体接触足W容许结合的一段时间，然后清洗所述测定表面；c)使所述测定表 面与和报告基团缀合的不同的要求保护的第二种抗体接触一段时间，该接触时间足W容许 所述第二种缀合单克隆抗体结合，然后清洗所述测定表面；和d)检测所述报告基团的存在 或不存在。本发明进一步一般性地包括用于定量测定PAT酶的方法，包括；a)将PAT特异性 单克隆抗体固定在测定表面上；b)使所述测定表面与怀疑含有PAT的液体接触足W容许结 合的一段时间，然后清洗所述测定表面；C)使所述测定表面与和报告基团缀合的不同的要 求保护的第二抗体接触一段时间，该接触时间足W容许所述第二缀合单克隆抗体结合，然 后清洗所述测定表面；和d)通过从比较到校准曲线插值来定量所述报告基团的存在。本发 明还包括使用该些mAbs分离或检测PAT的方法，包括；a)将所述抗体固定化到表面上；b) 使所述固定化的抗体与含有PAT的混合物接触；C)从所述混合物中分离与PAT结合的所述 固定化抗体；和d)通过从所述固定化抗体中移出与抗体结合的PAT来回收PAT。
[0009] 附图简述
[0010] 图1是化ISA标准曲线分析。纯化的重组PAT蛋白被稀释成7个浓度，范围是 0. 25-6.Ong/mL。使用450nm的光密度读数减去650nm的背景OD对浓度进行描点绘图。
[0011] 发明详细说明
[0012] 本发明包括特异性结合PAT的抗体和产生该些mAbs的杂交瘤。下表列出了要求 保护的杂交瘤细胞系命名及其相应的保藏日期。
[001 引
【主权项】
1. 一种特异性结合膦丝菌素-N-乙酰转移酶（PAT)的单克隆抗体，其选自下列单克隆 抗体的组：155AD4, 155E2.L114, 155Q3, 155Q12,和 155Q19. 1。
2. 权利要求1的单克隆抗体，由命名为155AD4的杂交瘤产生。
3. 权利要求1的单克隆抗体，由命名为155E2. 1. 114的杂交瘤产生。
4. 权利要求1的单克隆抗体，由命名为155Q3的杂交瘤产生。
5. 权利要求1的单克隆抗体，由命名为155Q12的杂交瘤产生。
6. 权利要求1的单克隆抗体，由命名为155Q19. 1的杂交瘤产生。
7. -种产生权利要求1的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其以选自下组的登录号保藏 在美国典型培养物保藏中心（ATCC) :PTA-13186，PTA-13187，PTA-13188，PTA-13189,和 PTA-13190。
8. 权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13186保藏。
9. 权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13187保藏。
10. 权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13188保藏。
11. 权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13189保藏。
12. 权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13190保藏。
13. -种用于鉴定PAT酶的存在的方法，包括： a) 将第一种权利要求1的单克隆抗体固定到测定表面上，然后清洗所述测定表面； b) 使所述测定表面与怀疑含有PAT的液体接触足以容许结合的一段时间，然后清洗所 述测定表面； c) 使所述测定表面与和报告基团缀合的不同的第二种权利要求1的抗体接触足以容 许所述第二种缀合单克隆抗体结合的一段时间，然后清洗所述测定表面；和 d) 检测所述报告基团的存在或不存在。
14. 一种用于定量测定PAT酶的方法，包括： a) 将PAT多克隆抗体固定到测定表面上； b) 使所述测定表面与怀疑含有PAT的液体接触足以容许结合的一段时间，然后清洗所 述测定表面； c) 使所述测定表面与和报告基团缀合的不同的第二种权利要求1的抗体接触足以容 许所述第二种缀合单克隆抗体结合的一段时间，然后清洗所述测定表面；和 d) 通过从校准曲线插值来定量所述报告基团的存在。
15. 权利要求14的方法，其中所述缀合单克隆抗体选自155Q12和155Q19. 1。
16. 权利要求14的方法，其中所述缀合单克隆抗体是155Q12。
17. 权利要求14的方法，其中所述缀合单克隆抗体是155Q19. 1。
【专利摘要】本文描述了用于确定和定量膦丝菌素-N-乙酰转移酶(phosphinothricin-N-acetyl-transferase)存在的单克隆抗体和方法。权利要求的抗体和方法特别用于确定和定量在转基因植物中表达的膦丝菌素-N-乙酰转移酶的存在。PTA-1318620120912 PTA-1319020120912 PTA-1318920120912 PTA-1318820120912 PTA-1318720120912
【IPC分类】G01N33-573, C12N5-12, C07K16-40
【公开号】CN104704003
【申请号】CN201380052572
【发明人】G·单, E·H·马
【申请人】美国陶氏益农公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年10月9日
【公告号】CA2886673A1, EP2906600A1, US20140099650, WO2014059002A1