包含两个Fab片段的无Fc的抗体及使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及包含至少两个F油片段的双特异性抗体，其中第一F油片段包含对第 一抗原特异的至少一个抗原结合位点；并且第二Fab片段包含对第二抗原特异的至少一个 抗原结合位点，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换；并且两个Fab片段通过 两个肤接头彼此连接，并且其中所述双特异性抗体缺少化结构域；设及用于产生它们的方 法，设及含有所述抗体的药物组合物和其用途。
[0002] 本发明进一步设及特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原（TA)的双特异性抗体， 其包含第一F油片段和第二F油片段，其中将第二F油重链和轻链的可变区或恒定区交换 和两个Fab片段通过两个肤接头彼此连接；并且其中双特异性抗体不包含化结构域；用于 产生它们的方法、含有所述抗体的药物组合物和其用途。
[000引背景
[0004] 单克隆抗体（mAb)是一类日益重要的治疗剂。除由全尺寸形式的IgG组成 的mAb产物之外，已经开发了类型广泛的多特异性重组抗体样式，例如由如IgG抗 体样式与单链结构域融合的四价双特异性抗体（见例如Coloma,M.J.等人，化ture Biotech15 (1997) 159-163 ;W0 2001/077342;和Morrison,S.L.,NatureBiotech 25(2007) 1233-1234)。
[000引已经开发了其中不再留下抗体核巧结构（IgA、I曲、I班、IgG或IgM)的几种其他 新样式如双体、=体或四体抗体、微型抗体，能够结合两种或更多种抗原的几种单链形式 (scFv、双scFvHHolliger,P.等人，化1:山"6 Biotech23(2005) 1126-1136;Fischer,N.,Le ger,0. ,Pathobiology74 (2007) 3-14;Shen, J.等人，Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74;Wu，C.等人，化Uire Biotech.25(2007) 1290-1297)。
[0006] 全部该类样式均使用接头W使抗体核巧（IgA、I曲、I班、IgG或IgM)与其他结合 蛋白（例如scFv)融合或W使例如两个F油片段或scFv融合（Fischer,N. ,L6ger, 0. ,Pa thobiology74(2007)3-14)。串联scFV是通过额外肤接头连接的两个scFv片段并且也 称作（scFv)2。通过减小可变结构域之间肤接头的长度，产生双体抗体（di油ody)。在两 种多肤之间添加额外肤接头产生了所谓的单链双体抗体。US2007/0274985设及包含单链 Fab(scFab)片段的抗体。与全尺寸单克隆抗体相比，抗体片段作为治疗剂具有优点和缺点： 一个优点在于它们更小并且更快地进入组织和肿瘤。此外，已经提出小尺寸的片段允许与 全尺寸单克隆抗体不可及的表位结合。缺点在于，片段在人类中显示短循环半寿期，该可能 归因于肾清除。较短半寿期可能妨碍治疗剂在祀向的部位充分积累。抗体片段的产生并不 繁琐，因为片段可能形成聚集物并且可能比全尺寸单克隆抗体不稳定。此外，非相关重链和 轻链的不想要配对导致无活性抗原结合位点和/或其他无功能的不想要的副产物的形成， 该在临床规模生产和治疗性应用抗体片段中是主要问题。具体而言，其中两个或更多个Fab 借助一种连接物彼此融合的串联-Fab构建体不是可行的，原因在于两条轻链的随机缔合 产生无活性、不想要的副产物。该些缺点现在已经用本发明的新抗体样式克服。本文中提 供一种新的双特异性抗体样式，所述双特异性抗体样式可W因错配副产物的量减少而W增 加的产率容易地产生，比本领域已知的双特异性抗体片段显示更少聚集。使用交换方案纠 正LC缔合可W在不需要产生共有轻链的情况下实现。常规的轻链法不可能用于现存的抗 体。进一步，新的双特异性抗体样式是稳定的并且在比现存双特异性样式更高的温度不聚 集，该允许更好的生产性和可发展性。此外，与许多常规双特异性抗体片段相比，该种新的 双特异性抗体样式具有更高的分子量，因此防止过度肾清除并导致改进的体内半寿期。新 的双特异性抗体样式具有完整功能并且具有与相应的常规双特异性抗体可比较的或改进 的结合作用和活性。
[0007] 在多种临床环境下经常希望选择性破坏单个细胞或特定细胞类型。例如，它是特 异性摧毁肿瘤细胞，同时留下健康细胞和组织不受损害的癌疗法的主要目的。一个方案是 选择性地诱导针对肿瘤的免疫反应，所述免疫反应引起免疫效应细胞如天然杀伤（NK)细 胞或细胞毒T淋己细胞（CTLs)攻击并随后破坏肿瘤细胞。CTL构成免疫系统的最强有力 效应细胞，然而它们不能由常规治疗性抗体化结构域介导的效应细胞机制活化。在该个方 面，能够与癌细胞上的表面抗原结合并能够结合至T细胞受体（TCR)复合物的不变活化组 分的双特异性抗体近几年已经变得有意义。双特异性抗体与其两种祀同时结合迫使癌细胞 和T细胞之间短暂相互作用，造成细胞毒T细胞活化和随后肿瘤细胞裂解。
[000引已经开发了几种双特异性抗体样式并且研究了它们对T细胞介导的癌症免疫疗 法的适用性。该些抗体样式当中，已经非常充分地表征了所谓的BiTE(双特异性T细胞 衔接体化ispecificTcellengager))分子并且它们已经在临床上显示一些有前景的 结果（综述见Nagorsen和Bauerle,ExpCellRes317,1255-1260(2011))。BiTE是其 中两个scFv分子通过柔性接头融合的串联scFv分子。被评价T细胞衔接作用的其他双 特异性样式包括双体抗体（di油ody)(Holliger等人，ProtE；ng9,299-305(1996))及 它们的衍生物，如串联双体抗体化ipriyanov等人，JMolBiol293,41-66(1999))。更 近的发展是所谓的DART(双亲和力再定向（化alaffinityretargeting))分子，其是基 于双体抗体样式，但是W起到额外稳定作用的C末端二硫键为特征（Moore等人，Blood 117, 4542-51 (2011))。所谓的S功能抗体（triomabs)，其是完整杂合小鼠/大鼠IgG分子 并且目前还在临床试验中评价，代表一种较大尺寸的样式（综述见Seimetz等人，Cancer TreatRev36,458-467(2010))0
[0009] 但是，迄今已知为T细胞介导的癌症免疫疗法所开发的双特异性抗体具有设及其 有效性、毒性和适用性的主要缺点。小构建体例如BiTE分子虽然能够有效地交联效应细胞 和祀细胞，但具有非常短的血清半寿期，需要将它们通过连续输注施用至患者。在另一方 面，IgG样样式虽然具有半寿期长的巨大益处，但遭遇与IgG分子内在的天然效应子功能相 关的毒性。对于成功的治疗性开发而言，该种免疫原性潜力构成IgG样双特异性抗体的另 一个不利特征。最后，在双特异性抗体的一般开发中的一个主要难题是W临床上足够的量 和纯度产生双特异性抗体构建体。共表达时不同特异性的抗体重链和轻链的错误配对减少 正确装配的构建体的产生并导致许多无功能的副产物。
[0010] 鉴于与目前可用于T细胞介导的癌症免疫疗法的双特异性抗体相关的难题和缺 点，仍需要该类分子的新颖改进样式。现在已经用本发明的新双特异性抗体克服了该些缺 点。新的双特异性抗体能够容易地产生，同时由于错配副产物的量减少而增加了新的双特 异性抗体的产量，所述抗体比本领域已知的双特异性抗体片段显示更少聚集。此外，与本领 域已知的双特异性抗体样式相比，新的双特异性抗体在增加的温度是稳定的。使用交换方 案能够实施正确的链缔合且不需要产生共有轻链。此外，与许多常规双特异性抗体片段相 比，新的双特异性抗体具有较高的分子量，因此防止过度肾清除并导致改进的体内半寿期。 进一步地，仅需要两种质粒W产生新的双特异性抗体。新的双特异性抗体具有完整功能并 且具有与相应的常规双特异性抗体可比较的或改进的结合作用和活性。
[0011] 本发明提供了设计用于T细胞活化和再定向的双特异性抗原结合分子，所述双特 异性抗原结合分子组合了良好的有效性和可生产性及低毒性和有利药代动力学特性。
[0012] 概述
[0013] 本发明设及包含至少两个F油片段的双特异性抗体，其中第一F油片段包含对第 一抗原特异的至少一个抗原结合位点；并且第二Fab片段包含对第二抗原特异的至少一个 抗原结合位点，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换；并且两个Fab片段通过 两个肤接头彼此连接，并且其中所述双特异性抗体缺少化结构域。优选地，所述肤接头是 佑4。2接头。
[0014] 在一个实施方案中，所述抗体额外地包含第=F油片段。在另一个实施方案中，所 述第=F油片段包含对第一或第二抗原特异、优选地对第一抗原特异的至少一个抗原结合 位点。
[0015] 在一个实施方案中，