基于CuS纳米粒子阳离子交换增强化学发光的生物传感器的制造方法
【技术领域】
[0001] 铜离子可以催化鲁米诺-过氧化氢体系化学发光，本发明利用银离子与硫化铜纳 米粒子的阳离子交换反应，瞬间释放大量铜离子，通过铜离子催化鲁米诺-过氧化氢体系 的化学发光，实现对目标物的检测。
【背景技术】
[0002] 化学发光分析是根据化学反应产生的光辐射强度确定物质含量的一种痕量分析 方法，化学发光分析突出的优点在于不使用任何外来光源，从而避免了瑞利散射和拉曼散 射等的干扰，大大提高了信噪比，因而化学发光分析法一般都有很高的灵敏度。同时，化学 发光分析仪器还具有设备简单、操作方便、快速，易于实现自动化等优点，在临床实验室中 广泛应用于激素、肿瘤标志物、传染病监测、血药浓度检测等。
[0003] 化学发光体系众多，其中鲁米诺的化学发光反应最受人们关注。鲁米诺及其衍生 物在碱性条件（pH10~11)下能够被很多氧化剂氧化发出微弱的光。其中H2O2最为常用。 进一步加入某些氧化剂或者催化剂，如NaC10、Fe(II)、Mn(II)、Cu(II)离子、黄嘌呤氧化 酶、辣根过氧化物酶、Hemin、过渡金属离子、一些增敏剂等，可以大大地提高化学发光强度。 其中，酶的催化性能较好，然而存在稳定差等缺点。而金属或半导体纳米粒子由于其独特的 光学及电学性质被广泛应用于生物样品的标记中。
[0004] 利用标记的纳米粒子增强化学发光一般是通过酸溶的办法得到相应的金属离子， 例如Liu等（Anal.Chem. 2006, 78, 3738 - 3744)将银纳米粒子标记在DNA上作为探针，酸 溶后产生银离子，通过Ag+-Mn2+-K2S2O8-H3PO4-Luminol化学发光体系对银离子的高灵敏度响 应，实现对DNA片断的超微量检测。本课题曾利用金胶负载大量CuS纳米粒子作为探针，酸 溶后产生大量Cu2+，结合溶出伏安法提高检测灵敏度（Anal.Chem. 2008, 80, 7206 - 7212)。 酸溶的方法一般采用浓硝酸，这样一方面由于浓硝酸的加入会降低体系的pH值，不利于鲁 米诺的化学发光；另一方面强酸会对生物样品造成破坏，使传感器不能够循环使用。
[0005] 2004年Son等首次报道了离子化纳米粒子的阳离子交换反应（Science, 2004， 306,1009-1012)，CdSe纳米粒子与银离子在甲苯溶液中可以瞬间发生阳离子交换，生 成Cd2+和Ag2Se纳米粒子；Li等在水相中将CdSe纳米粒子标记与蛋白分子上，利用上 述反应释放大量镉离子，大大增强Fluo-4的荧光，发展了基于阳离子放大的荧光增强 (CXFluoAmp)检测生物分子的方法（Angew.Chem.Int.Ed. 2009, 48, 1588 - 1591)。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是将CuS纳米粒子标记在信号分子上，其与银离子发生阳离子交换 反应后，利用生成的铜离子增强鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光实现对生物样品的检 测。
[0007] 本发明所提供的方法包括以下步骤：
[0008] (1)将捕获探针分子固定于固相载体表面。
[0009] 所述的方法，其所述的捕获探针分子可以为捕获DNA或一抗。
[0010] 所述的方法，其所述的固相载体可以为磁珠、电极、微球或微孔板。
[0011] (2)制备羧基修饰的CuS纳米粒子，将其标记在信号分子上，制备信号探针。
[0012] 所述的方法，其所述的信号分子可以为信号DNA或二抗。
[0013] (3)将待测目标分子与步骤（1)和步骤（2)中得到的产物共同孵育，分离纯化后得 到组装的传感器。
[0014] 所述的方法，其所述的目标分子为目标DNA或待测抗原。
[0015] (4)向步骤（3)中组装的传感器中加入硝酸银，将反应后的溶液加入到化学发光 反应池，加入鲁米诺溶液，向反应体系注射过氧化氢溶液，化学发光仪记录光强随时间的变 化。
【附图说明】
[0016] 附图1基于CuS纳米粒子阳离子交换增强化学发光的原理。
[0017] 附图2化学发光强度随时间的变化图。a曲线，目标DNA的浓度为4.OXKT12M;b 曲线，空白。
[0018] 附图3银离子对化学发光的干扰。其中AgNO3的浓度依次为I:4.OXKT4M;2 : 4.OXKT6M;3 :4.OXHT8M;4 :4.OXKT10M;5 :4.OXKT12M;6 :4.OXKT14M;7 :4. 0XKT16M15
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式 限制本发明。
[0020] 实施例1
[0021] LCuS纳米粒子的合成
[0022] 巯基丙酸修饰的CuS纳米粒子依照文献进行制备（Anal.Chem. 2008, 80, 7206 -7212)。将15iiL的巯基丙酸加入到50mL0. 4mM的Cu(NO3) 2溶液中，用0. 5M的NaOH溶液将 混合溶液的pH值调至7. 0。通入N2除氧30min后，将N2除氧的50mLl. 34mM的Na2S溶液滴 加到混合溶液中。反应在N2保护下，于水浴28°C搅拌反应24h，反应过程中溶液由棕色逐 渐转变为墨绿色。将CuS纳米溶胶于截留分子量为7000Dollon的透析袋中避光透析48h， 4°C保存备用。
[0023] 2.CuS纳米粒子修饰DNA探针的制备
[0024] 在IOmL的小烧杯中依次加入2.OXKT6M的3'位修饰氨基的DNA探针溶液2mL和 pH6. 8,0.IM的咪唑溶液200iiL。室温搅拌反应30min后，将100iiL，0.IM的EDC溶液和 3.OmLCuS纳米溶胶加入到混合溶液中，室温下搅拌反应12h。最后，标记了CuS纳米粒子 的DNA探针在1000 Orpm下离心30min，沉淀物用水冲洗后再次分散悬浮在水中。将CuS纳 米粒子标记的DNA探针于4°C下保存。
[0025] 3.DNA包被磁珠的制备
[0026]移取10UL羧基磁珠用0.IM咪唑-HCl缓冲液（pH= 6. 8)，重复洗涤三次。最后 一次洗涤后，重悬磁珠于10UL的咪唑-HCl缓冲液中。
[0027] 洗涤后的磁珠加入100yL0.IM咪唑-HCl-EDC(以0?IM咪唑-HCl缓冲液作溶剂 溶解EDC)，震荡摇匀，将离心管置于振荡器中，25°C下活化30min后磁分离，洗涤磁珠四次。
[0028] 最后一次洗涤后，重悬磁珠于IOiiL连接缓冲液（pH= 7.4的0.OlMPBS(含 0.IMKCl))中，加入IOiiLI.OXKT6M氨基修饰的DNA，于震荡反应器中37°C下反应12h。分 离除去未连接的DNA，可获得包被了捕获DNA的磁珠。
[0029] 4.CuS纳米粒子阳离子交换反应
[0030] 加10UL-定浓度的目标DNA于包被了捕获DNA的磁珠中，充分震荡摇匀，置于 震荡反应器中37°C反应lh，磁分离去除未连接的目标DNA。向上述体系加入IOOiiLCuS纳 米粒子标记的DNA，于震荡反应器中37°C连接反应lh。充分洗涤5次，加入25iiL浓度为 8XKT4M的AgNO3，震荡混匀后于25°C下反应lOmin。磁分离取上清液用于化学发光检测。 阳离子交换后得到的溶液采用ICP-Ms验证有铜离子生成（见表1)。
[0031] 表IICP-Ms检测得不同样品中Cu2+浓度
【主权项】
1. 基于CuS纳米粒子阳离子交换增强化学发光方法制备生物传感器，步骤包括： (a) 首先利用巯基丙酸、Cu(N03)2和Na2S制备羧基官能团化的CuS纳米粒子； (b) 将与步骤（a)中的羧基官能团化的CuS纳米粒子与带有氨基的生物分子偶联，得到 CuS纳米粒子标记的信号分子； (c) 在固相载体上固定捕获分子，用于与目标分子的特异性识别； (d) 在步骤（c)中得到的修饰有捕获分子的固相载体中加入目标分子及CuS纳米粒子 标记的信号分子，得到三明治夹心复合结构； (e) 在步骤（d)得到的三明治夹心复合结构中加入AgN03溶液，进行阳离子交换反应； (f) 移取步骤（e)得到的反应上清液，用于鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光检测，根 据化学发光的强度，实现对目标物的定量检测。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（b)中带有氨基的生物分子可以为 氨基修饰的DNA或抗体。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（c)中的固相载体可以为磁珠、电 极、微球或微孔板。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（c)中的捕获分子可以为DNA或抗 体。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（d)中的目标分子可以为目标DNA、 RNA、细胞或抗原。
【专利摘要】基于CuS纳米粒子阳离子交换增强化学发光的生物传感器，将硫化铜纳米粒子标记在生物分子上，通过生物识别作用得到标记硫化铜的复合结构。向体系加入硝酸银，硝酸银与硫化铜纳米粒子瞬间发生阳离子交换反应，生成铜离子。然后利用生成的铜离子催化鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光，实现对目标物的定量检测。
【IPC分类】G01N21-76
【公开号】CN104655615
【申请号】CN201410323136
【发明人】张晓茹, 张园, 刘洪霞
【申请人】青岛科技大学, 临沂大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2014年7月8日