用于检测肿瘤标志物muc1的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种电化学发光适配体传感器，尤其是涉及一种用于检测肿瘤标志物 MUCl的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 近年来全球癌症发病状况日趋严重，死于恶性肿瘤的患者逐年增多，能够实现对 肿瘤的早期诊断和治疗是降低死亡率的关键，目前癌症的临床诊断主要通过监测人体内肿 瘤标志物的含量实现。肿瘤标志物是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身产生或 者由宿主对体内肿瘤反应而产生的一类生化物质,包括肿瘤相关蛋白类标志物、激素类标 志物、酶类标志物、基因类标志物和胚胎抗原等，可在肿瘤组织、血液、体液或排泄物中检测 出来。
[0003]MUCl又名多态性上皮粘蛋白，是一种广泛分布于机体各种粘膜表面的高分子量糖 蛋白。正常情况下MUCl主要表达于多种器官、组织上皮细胞的细胞膜胞膜顶端，呈顶端分 布或极性分布，但在多种肿瘤细胞中，MUCl的表达出现量和质的改变，并与肿瘤的浸润、转 移及预后相关，是一种非常有价值的肿瘤标志物。因此，简单、快速、准确地检测肿瘤标志物 MUC1，对多种癌症的早期诊断及预后判断具有重要意义。
[0004]目前，检测肿瘤标志物MUCl的方法主要有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶 联免疫分析法和电化学免疫分析法等，这些方法都是基于抗原一抗体特异性结合反应，灵 敏度高、特异性强，但也存在一个共同的不足之处，即抗体难以获得、成本高、稳定性差，除 此之外，上述方法或具有放射性危害、或操作过程繁琐、或检测成本偏高。因此，开发灵敏度 高、特异性强、简单价廉于一体的分析方法，实现肿瘤标志物MUCl的快速检测，仍是当前的 迫切需求。
[0005]核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术（SELEX)筛选出的、可通过折叠形 成特定空间结构与靶分子特异性结合的人工单链DNA或RNA序列，具有高特异性、高亲和 性，被喻为"化学抗体"。作为分子识别体系，与抗体相比，核酸适配体的优越性是显著的：① 抗体必须使用动物或者细胞系产生分子，而核酸适配体通过体外方法合成与分离；②核酸 适配体容易并且可重复合成，批次间的差异小，易于保存，稳定性、亲和性和特异性均优于 抗体；③核酸适配体对温度有高度的稳定性，而抗体是大蛋白分子，对温度敏感，会产生不 可逆的变性。因此，核酸适配体在生物传感与分析分离、核酸功能研究、核酸自组装材料及 器件、疾病诊断与治疗等研究领域，展现出广阔的应用前景。
[0006]电化学发光（ECL)是对浸入含电化学发光物质的体系的电极施加一定电压或者电 流而产生的化学发光现象，综合了电化学和化学发光的优点，是一种灵敏度高、可视性强、 仪器简单、可控性强、稳定性好、重现性好的分析方法。目前，国内外还没有公开任何关于基 于磁性氧化石墨烯、电化学发光体和对肿瘤标志物MUCl具有特异性识别能力的核酸适配 体的用于检测肿瘤标志物MUCl的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用方面的相 关研究报道。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种组装过程简单，操作方法简便，检测结果 灵敏和准确性高、特异性强的用于检测肿瘤标志物MUCl的电化学发光适配体传感器的制 备方法及其应用。
[0008] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测肿瘤标志物MUCl 的电化学发光适配体传感器的制备方法，包括以下步骤： (1) 多功能化氧化石墨烯材料的合成 a. 磁性氧化石墨烯的合成：在洁净的三颈烧瓶中加入30~50mLImg/mL的氧化石 墨烯（G0)，超声Ih;然后在氮气氛保护下加入20~30mL0.05~0.07mol/L的氯化亚 铁溶液和20~30mL0. 10~0. 15mol/L的氯化高铁溶液，于70~90°C搅拌回流，同时 缓慢滴加10~15mL20%~30%的氨水至溶液的pH= 10~11，回流处理3~5h;冷却 后，用二次水洗涤至溶液的pH= 7,定容到50mL，即得磁性氧化石墨烯材料溶液，4 °C储存 备用； b. 取步骤（a)中所得的磁性氧化石墨烯材料溶液200UL于玻璃瓶中，超声lh，然后 加入200~400iiL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸溶液至溶液pH= 4~6,振荡孵 育Ih，二次水洗涤3次；再加入30~50iiL0. 001~0.Imol/L的电化学发光体溶液和 30~50iiL10~20iimol/L的适配体溶液，混合均匀，然后滴加氢氧化钠溶液至溶液pH =8~10,振荡孵育4h，二次水洗涤3次；加入质量百分浓度为1~2%的牛血清白蛋白溶 液100~200iiL，4°C下浸泡Ih，以封闭电极表面的非特异性活性位点，二次水洗涤3次， 定容至200yL，即可得到适配体和电化学发光体同时标记的多功能化氧化石墨烯材料溶 液，4 °C下储存备用； (2) 电化学发光适配体传感器的组装 将直径为3~5mm的磁性玻碳电极依次用L0iim、0. 3iim和0? 05iim的三氧化二 铝浆抛光打磨，然后在乙醇和二次水中分别超声2min，氮气吹干；取5~10yL步骤（1) 中制备的多功能化氧化石墨烯材料溶液，滴涂到上述预处理过的磁性玻碳电极表面，多功 能化氧化石墨烯材料即被均匀、牢固地吸附到电极表面，即得电化学发光适配体传感器。
[0009] 所述的电化学发光体溶液中溶质为鲁米诺或N- (4-氨基丁基）-N-乙基异鲁米诺， 溶剂为0.lmol/L氢氧化钠溶液。
[0010] 所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)与N-羟 基琥珀酰亚胺（NHS)溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐（EDC)的摩尔浓度为10~100mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)摩尔 浓度为1~10mm〇l/L。
[0011] 所述的适配体为氨基修饰的DNA片段，碱基序列为：5' -NH2-GCAGTTGATCCTTTGGAT ACCCTgg-S'。
[0012] 利用上述电化学发光适配体传感器检测肿瘤标志物MUCl的方法，具体步骤如下： 将上述制备的用于检测肿瘤标志物MUCl的电化学发光适配体传感器浸泡在不同浓度 的肿瘤标志物MUCl溶液中，37°C下温育Ih，然后使用二次水轻轻洗涤后作为工作电极；使 用钼丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极或饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将 三电极体系置于缓冲溶液中，启动电化学反应，测量体系的电化学发光强度值；获得一系列 不同浓度的肿瘤标志物MUCl溶液对应的电化学发光强度值，建立电化学发光强度值与肿 瘤标志物MUCl浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以检测待测样品中肿瘤标志物 MUCl的浓度。
[0013] 所述的缓冲溶液为含有1~3mmol/LH2O2的0? 05mol/LpH= 9~11的 似2(：03-似11(：03体系缓冲溶液。
[0014] 电化学反应的条件如下：电位阶跃计时电流法；脉冲宽度：0. 25秒；脉冲间隔：30 秒；初始电压：〇V;脉冲电压：1V。
[0015] 发明原理：多功能化氧化石墨烯材料是在氧化石墨烯上同时修饰有四氧化三铁纳 米磁珠、适配体和电化学发光体的复合材料，具有多种功能：（1)氧化石墨烯具有比表面积 大、表面官能团多和生物相容性好等优点，因此可以负载大量的四氧化三铁纳米磁珠、适配 体和电化学发光体；（2)四氧化三铁纳米磁珠不仅具有超强的磁性，使多功能化氧化石墨 烯材料均匀、牢固地吸附到电极表面，实现电化学发光适配体传感器的一步组装，简化传感 器的制备方法，同时还具有优良的导电性，增强多功能化氧化石墨烯材料的导电性，促进电 极表面的电子传递过程；（3)适配体对肿瘤标志物MUCl具有特异性的识别能力，可以特异 性地识别并捕获溶液中的肿瘤标志物MUCl; (4)电化学发光体在电化学反应中可产生强而 稳定的电化学发光信号。
[0016] 本发明将多功能化氧化石墨烯材料滴涂到磁性玻碳电极表面后即可