用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种电化学发光免疫传感器及其检测方法，尤其是涉及一种用于检测 海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用方法。
【背景技术】
[0002] 海洋致病菌是生活在海洋中、不含叶绿素和藻蓝素的原核单细胞生物。海洋致病 菌以革兰氏阴性杆菌为主，常见的菌属有弧菌属、假单胞杆菌属、不动杆菌属、棒状杆菌属、 黄杆菌属、螺菌属、芽孢杆菌属等。海洋致病菌会导致海洋水产动物如鱼、虾、蟹、贝类等患 病，人类如果进食受海洋致病菌污染的海产品，可导致胃肠道疾病如：腹痛、呕吐、腹泻、脱 水、休克、昏迷，甚至死亡；通过伤口或接触性感染可导致中耳炎、泌尿系统感染、败血症等 疾病。因此，快速准确地检测海洋致病菌，对保护海洋水产动物、减少经济损失和促进人类 健康具有重要意义。
[0003]目前海洋致病菌的检测方法主要有：传统的培养方法；免疫学方法如：酶联免疫 吸附（ELISA)法、免疫荧光抗体技术等；分子生物学技术如：聚合酶链式反应（PCR)、环介导 等温扩增技术（LAMP)、变性高效液相色谱（DHPLC)技术、DNA芯片技术等；传感器技术如电 化学技术、电子鼻技术等。目前，国内也有基于上述方法的检测海洋致病菌的一些相关专 利：用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒及方法（200710027105. 6);霍乱弧菌、副 溶血弧菌和创伤弧菌的三重PCR检测方法（201210037697. 0);-种应用多重PCR快速检测 致病性溶藻弧菌的方法（200610124337. 9);等。这些方法有些检测周期长、技术要求高，有 些仪器昂贵、操作复杂、步骤繁多、容易出现假阳性，有些特异性不强、灵敏度不高。因此，开 发灵敏、准确、快速、简便的海洋致病菌检测方法是迫切需求。
[0004] 免疫传感器是基于抗原-抗体的特异性亲和作用、将特异性免疫反应与适宜的信 号转换技术相结合、用以检测目标抗原的生物传感器，具有特异性强、可逆性好、试剂利用 效率高等优点。电化学发光（ECL)免疫传感器是集电化学发光和免疫传感器为一体的技术， 具有灵敏度高、线性范围宽、检测迅速、稳定性好、不使用放射性试剂等优点。但是，目前未 见检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测方法简单、快速，检测结果灵敏度和 准确性高、特异性强的用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应 用。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测海洋致病菌的电化 学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤： (1)多功能化石墨烯材料的合成 a.磁性氧化石墨烯的合成：在干净的烧瓶中加入30~50mL的Img/mL氧化石墨烯 (G0)，超声Ih;然后在氮气气氛保护下加入20~30mL0.05~0.07mol/L氯化亚铁溶 液和20~30mL0. 10~0. 15mol/L氯化高铁溶液，于70~90°C搅拌回流，同时缓慢滴加 10~15mL20%~30%氨水至溶液pH= 10~11，回流处理3~5h后冷却；再用水洗涤 至PH= 7,定容为50mL，即得磁性氧化石墨烯材料溶液，4 °C储存备用； b.取步骤（a)所得磁性氧化石墨烯材料溶液200UL于试管中，超声Ih，然后加入 200~400iiL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸至溶液pH= 4~6,振荡孵育Ih后，水 洗3次；再加入30~50iiL0. 001~0.Imol/L电化学发光体溶液和30~50iiL0. 1~ IUg/mL海洋致病菌抗体溶液，混合均匀，同时滴加0.Imol/L氢氧化钠溶液至溶液pH= 8~10,振荡孵育4h后，水洗3次；加入质量百分浓度为2%的牛血清白蛋白溶液50~100 UL以封闭非特异性活性位点，4°C下孵育Ih后，水洗3次，定容为200yL，即可得到海洋 致病菌抗体和电化学发光体同时标记的多功能化石墨烯材料溶液，4 °C下储存备用； (2)电化学发光免疫传感器的组装 将直径为3~5臟的磁性玻碳电极依次用1.〇11111、0.3 111]1、0.05 111]1的三氧化二错 浆抛光处理，在乙醇、水中依次超声2min，洗净，氮气吹干；取5~10iiL步骤（1)得到的 多功能化石墨烯材料溶液，滴涂于上述已处理的磁性玻碳电极表面，多功能化石墨烯材料 即被均匀、牢固地吸附于电极表面；即得到用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器。
[0007] 所述的电化学发光体溶液中溶质为鲁米诺或N-(4-氨基丁基）-N-乙基异鲁米诺 (ABEI)，溶剂为0?lmol/L氢氧化钠溶液。
[0008] 所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)与N-羟 基琥珀酰亚胺（NHS)溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐（EDC)的摩尔浓度为10~100mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)摩尔 浓度为1~10mm〇l/L。
[0009] 所述的海洋致病菌为创伤弧菌（VV)、副溶血弧菌（VP)、哈维氏弧菌（VH)、阴沟肠 杆菌（EC)或黄海希瓦氏菌（SM)。
[0010] 一种利用上述电化学发光免疫传感器检测海洋致病菌的方法，具体步骤如下： 将用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器浸泡在含有不同浓度的海洋致病菌 溶液中，于37°c下温育Ih后取出，水清洗后，作为工作电极；采用钼电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将三电极体系放入缓冲溶 液，启动电化学反应，测定电化学发光强度；获得一系列不同浓度的海洋致病菌溶液对应的 电化学发光强度值，建立电化学发光强度值与海洋致病菌溶液浓度之间的定量关系；根据 这个定量关系检测待测样品中海洋致病菌的浓度。
[0011] 所述的缓冲溶液为含有1~3mmol/LH2O2的0. 05mol/LpH9~11的 似2(：03-似11(：03体系缓冲溶液。
[0012] 所述的电化学反应的条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：〇. 25秒；脉冲间 隔：30秒；初始电压：0V;脉冲电压：1V。
[0013] 发明原理：多功能化石墨烯材料，在氧化石墨烯上同时负载有纳米四氧化三铁粒 子、海洋致病菌抗体和电化学发光体，具有多种功能：（1)氧化石墨烯具有巨大的表面积和 丰富的表面基团，可以负载大量的纳米四氧化三铁粒子、海洋致病菌抗体和电化学发光体， 且具有良好的导电性，有利于电子传递，增强电化学发光；（2)纳米四氧化三铁粒子，可以 使得多功能化石墨烯材料均匀、牢固地吸附于电极表面，实现电化学发光免疫传感器的一 步制备，极大简化了传感器制备方法，且纳米四氧化三铁粒子可以进一步提高多功能化石 墨烯材料的导电性；（3)海洋致病菌抗体，可以特异性识别、俘获海洋致病菌；（4)电化学发 光体，可以给出电化学发光信号；（5) -体化的多功能化石墨烯材料，使得所有负载的电化 学发光体都处于电极表面的外赫姆霍兹面之内，都可以产生电化学发光信号，进一步提高 电化学发光强度。
[0014] 本发明将多功能化石墨烯材料滴涂于磁性玻碳电极表面之后，功能化石墨烯材料 即被均匀、牢固地吸附于电极表面，构建成电化学发光免疫传感器，电化学反应激发下，即 会产生稳定的电化学发光；如果样品中含有海洋致病菌，海洋致病菌就会被电化学发光免 疫传感器中的海洋致病菌抗体俘获，阻碍电极表面的电子传递和电化学发光，电化学发光 强度降低；海洋致病菌浓度越大，电化学发光强度越低，电化学发