基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测链霉素的生物传 感器，还涉及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 链霉素（streptomycin,SM)是一种常见的氨基葡萄糖型抗生素，是由土壤放 线菌产生的，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有显著的抗菌效果，能够有效抑制细 菌的生长和繁殖（如：结核病、鼠疫、百日咳、细菌性痢疾、泌尿道感染和主要由革兰氏阴性 细菌引起的其他传染病）。可有效防治植物细菌病害，例如：梨火疫病、蓝莓菌、烟草野火病 等，因此目前常用于畜牧业和水产业中。然而链霉素在畜牧业中的滥用造成农产品中的药 物残留引发一些疾病。因此，检测食品中的链霉素的残留量已变得非常重要。
[0003] 检测链霉素的方法主要有链霉素的检测方法主要包括微生物法、免疫分析法、色 谱法和其他方法。
[0004] 目前，主要用来检测链霉素的方法包括微生物法和高效液相色谱法（HPLC)。然而 这两种方法均存在自身不可避免的缺陷。微生物分析法的稳定性差，灵敏度低，菌不易筛 选；而HPLC需要较为昂贵的样品预处理。因此，目前需要建立一种高灵敏度，高效，特异性 检测链霉素的方法来检测食品中残留的链霉素。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中检测链霉素的方法的缺陷，本发明提供一种高特异性和灵敏 性、成本低、高效快速的基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器。同时，本发明还提供了 基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器的制备方法。
[0006] 本发明是通过以下步骤得到的： 本发明中一共用到了 3条DNA链： ① 一发卡结构HAP，其作用是特异性识别并捕获链霉素 ② 一条ssDNA辅助单链 ③ 一条修饰在金电极表面的MBcaptureprobe，能与ssDNA完全互补 三条DNA链序列： Aptamer即HAP: 3?-GGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTGCAGGCGGATCCAGACCCCAAACACAA-5' (SEQIDNO： 1)； ssDNA:3'-GTCTGGATCCGCCTGC-5'（SEQIDN0:2); MBcaptureprobe:3'SH-GCAGGCGGATCCAGAC-MB5' （SEQIDN0:3)〇
[0007] 发卡结构HAP3'端（HAP序列中的加粗部分）可以与链霉素特异性识别并紧密结 合，发卡构象发生变化。
[0008] 辅助链ssDNA可以与发卡部分碱基（HAP序列中有下划线部分）互补配对。
[0009] 修饰有亚甲基蓝（MB)捕获探针（MBcaptureprobe)的碱基序列与ssDNA完全互 补。其3'端修饰有巯基（-SH)，可以与金电极形成稳定的Au-S键，从而将捕获探针固定在 电极表面。其5'端修饰有亚甲基蓝（MB)，它可以一定的电位下发生氧化还原反应，我们就 是通过检测MB氧化还原信号差值来达到定量的检测目标物的目的。
[0010] 本发明中用到了一种酶：限制性核酸外切酶ExoIII。ExoIII能且只能剪切DNA双 链，可以将与HAP杂交的ssDNA剪切掉，得以循环，实现信号放大。
[0011] 本发明中链霉素的检测是在均相溶液中实现的，通过一步循环的方式来实现信号 的放大，从而实现链霉素的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
[0012] 均相中发生的反应主要有：发夹结构的DNA中有目标物的适配体，在有目标物存 在的情况下，该适配体序列能够特异性的识别目标物并与之结合，发生构型转变，从而将发 夹结构链打开。此时均相中的ssDNA就可以与打开的发夹结构发生互补配对，从而将ssDNA 与HAP固定到一起。此时在ExoIII核酸外切酶的作用下，将杂交的双链上ssDNA水解。使 打开的HAP可以与其他ssDNA杂交，实现HAP的循环利用及信号的循环放大。由于单链的 MBcaptureprobe是一种柔性结构，5'端的MB离电极表面很近，可以产生较大的电信号。 当MBcaptureprobe与ssDNA杂交后，形成的杂交双链是一种刚性结构，致使5'端的MB 远离电极表面，阻碍了MB与电极之间的电子传递，产生的电信号降低。本发明就是根据反 应前后的电信号差来实现目标物的定量检测。
[0013] 在均相反应中，放大的反应条件为37°C，反应时间是2h。
[0014] 一种基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器，在金电极上依次修饰有MB captureprobe层、HAP与ssDNA层； 所述的生物传感器，MBcaptureprobe层的厚度为10±2nm、HAP与ssDNA层的厚度 为 15zh2nm〇
[0015] 所述的生物传感器，HAP层中HAP(摩尔）与ExoIII(活性）的摩尔与活性的比为 1 ：250〇
[0016] 所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤： (1) 对电极进行预处理； (2) 将MBcaptureprobe层修饰到电极表面； (3 )将HAP层修饰到电极表面。
[0017] 所述的制备方法，优选将MBcaptureprobe层修饰到电极表面的操作步骤如下： 将10yM的captureprobe10yL滴加到经过预处理的电极表面，在25°C下孵育2h。
[0018] 所述的制备方法，优选将HAP层修饰到电极表面的操作步骤如下： (1) 将灭菌水，IOX的buffer缓冲液、ssDNA、HAP和待测目标物加入离心管中，震荡 30s，放入37°C的恒温箱中孵育2h; (2) 向离心管中加入核酸外切酶，震荡30s，放入37°C的恒温箱中孵育2h; (3) 将孵育好的混合溶液滴加到修饰好MBcaptureprobe层的电极上，将电极继续放 在37°C的恒温箱中孵育2h，清洗。
[0019] 所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为电极在0. 3和0. 05yM的氧化铝 浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。
[0020] 所述的制备方法，优选所述电极为金电极。
[0021] 该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极， 钼丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将MBcaptureprobe 固定到电极表面。然后将反应后的均相溶液修饰到电极表面，在37°C孵育2h使均相中的 ssDNA与电极表面的MBcaptureprobe完成杂交反应，从而将ssDNA固定到电极表面。然 后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极， 电位设置为〇到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06S，采用差分脉冲伏安技术读取 MB电信号的变化，检测待测目标物。
[0022] 本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，该传感器具有检测速度快，检测 限低，特异性高等优点，可以弥补链霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确 的定量检测。
[0023] 本发明的有益效果： 1、 利用了核酸适配体的特异型识别，利用链霉素的适体作为识别物质实现了对目标物 链霉素的高特异性检测； 2、 利用核酸外切酶，实现了目标物的循环利用，起到了信号放大的作用；实现了对目标 物的尚敏检测，提尚了检测的灵敏度； 3、 该传感器的反应条件温和，反应速度快； 4、 由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用； 5、 检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高的反应速度，降低了操作的复杂程 度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测； 7、 制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中链霉素的检测和生物 传感器产业化的实际应用； 8、 制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
[0024]
【附图说明】 图1为实施例41标准曲线图。
[0025] 图2为本发明的结构示意图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0027] 实施例1 一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法： a、 金电极首先在0. 3和0. 05ym的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和 二次水反复冲洗； b、 将IOyL的MBcaptureprobe(IOyM)滴加到电极表面，在室温下孵育2h。通过 Au-S键将巯基链固定到电极表面； 至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中 的主要步骤： a、将灭菌水，IOX的缓冲液（buffer)，IyL浓度为50yM的ssDNA，IyL发夹结构 的DNA链（10yM)和IyL不同浓度的目标物（lOOpM，500pM，InM，5nM，10nM，50nM，lOOnM， 500nM，IyM)加入到预先准备好的灭菌的离心管中。震荡30s，然后将混匀的混合液放入 37°C的恒温箱中孵育2h; b、 继续向a步的离心管中加入核酸外切酶（IyL)。震荡30s，然后将混匀的混合液继 续放入37°C的恒温箱中孵育2h; c、 将b步反应后的溶液（IOyL)滴加到预先修饰好captureprobe的电极上。然后将 电极继续放在37 °C的恒温箱中孵育2h; d、 用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次lOmin，共清洗3次。
[0028] 以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0. 5V，脉冲宽度 0. 05V，扫描速率为0. 06s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。
[0029]
【主权项】
1. 一种基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器，其特征在于，在金电极上依次修饰 有MBcaptureprobe层、HAP与ssDNA层。
2. 根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述的生物传感器，MBcapture probe层的厚度为10 ±2nm、HAP与ssDNA层的厚度为15 ±2nm。
3. -种权利要求1或2所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 对金电极进行预处理； (2) 将MBcaptureprobe层修饰到电极表面； (3) 将HAP与ssDNA层修饰到电极表面； 所述的MBcaptureprobe的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 所述的HAP的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示； 所述的ssDNA的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)的具体操作步骤为，取金电 极在0. 3和0. 05yM的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)的具体操作步骤为：将 IOyM的captureprobeIOyL滴加到经过预处理的金电极表面，在25°C下孵育2h。
6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)的具体操作步骤为： 1) 将灭菌水，10X的buffer缓冲液、InL的浓度为50yM的ssDNA、InL的浓度为 10yMHAP和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37°C的恒温箱中孵育2h; 2) 向离心管中加入核酸外切酶ExoIII，震荡30s，放入37°C的恒温箱中孵育2h; 3) 将孵育好的混合溶液滴加到修饰好MBcaptureprobe层的电极上，将电极继续放在 37°C的恒温箱中孵育2h，清洗； 其中，HAP层中HAP(摩尔）与核酸外切酶ExoIII(活性）的摩尔与活性的比为1 :250。
【专利摘要】本发明提供基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器，包括金电极，金电极上依次修饰有MB capture probe层、HAP与ssDNA层；同时，提供了其制备方法，本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补链霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
【IPC分类】G01N33-543, G01N27-327, G01N27-48
【公开号】CN104764790
【申请号】CN201510135113
【发明人】王玉, 崔洁, 黄加栋, 刘素, 徐伟, 王虹智, 郭玉娜, 许颖, 邱婷婷
【申请人】济南大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月26日